赤芍总苷对人黑色素瘤细胞株凋亡诱导的作用机制

目的观察赤芍总苷(TPG)对人黑色素瘤A375细胞凋亡的影响并探讨其机制。方法将12.5、25、50、100、200 mg/L TPG分别加入体外培养的黑色素瘤细胞,对照组加等量生理盐水,孵育24、48 h后MTT测定细胞生长抑制率;25 mg/L TPG孵育细胞48 h,收集细胞,FCM测定细胞凋亡率;RT-PCR和Western blot分别测定Caspase-3、Bcl-2、Bax、Fas、FasL mRNA和蛋白的表达水平。结果 TPG抑制A375细胞生长作用明显,25 mg/L TPG孵育黑色素瘤细胞48 h后,细胞凋亡率增高,Caspase-3、Bax、Fas、FasL mRNA和蛋白表达也明显升高,Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平下降,Bcl-2/Bax比值显著降低(均P<0.05)。结论 TPG可诱导黑色素瘤肿瘤细胞凋亡,其机制与上调Caspase-3、Fas和FasL表达水平,下调Bcl-2,降低Bcl-2/Bax比值密切相关。

慢病毒介导shRNA沉默巢蛋白表达对人黑色素瘤细胞转移特性的影响

目的应用慢病毒介导的RNA干扰技术,有效沉默黑色素瘤细胞株UACC903巢蛋白(nestin)的表达,研究其对黑色素瘤细胞转移能力的影响。方法以人nestin mRNA编码序列作为干扰靶点,以慢病毒基因PLL3.7作为质粒载体,构建靶向人nestin的shRNA表达质粒,另构建不针对任何已知mRNA的阴性对照shRNA表达质粒,分别感染UACC903细胞并流式分选获得高纯度的nestin干扰或对照组细胞。应用RT-PCR、免疫荧光及Western blotting检测不同组别nestin表达的变化。分别用Transwell侵袭试验检测跨膜细胞的数量评估各组黑色素瘤细胞的侵袭能力,划痕法检测迁移能力改变。光镜观察各组细胞形态变化,免疫荧光检测E-cadherin、N-cadherin和β-catenin在不同组别的表达变化。结果成功构建nestin shRNA慢病毒载体nestin-RNAi-LV。RT-PCR及免疫荧光结果显示干扰组UACC903细胞nestin mRNA及蛋白表达水平较对照组显著降低。nestin下调的UACC903细胞黏附、侵袭及迁移能力下降(P<0.05)。结论慢病毒介导的shRNA能有效地静默食管癌细胞nestin基因的表达,能抑制黑色素瘤细胞UACC903迁移。

银杏叶多糖对人恶性黑色素瘤细胞增殖的影响

研究了银杏叶多糖(PGBL)对人恶性黑色素瘤(A375)细胞增殖的影响。采用50μg.ml-1、100μg.ml-1和200μg.ml-1浓度的PGBL作用于A375细胞,MTT法检测细胞生长和增殖情况。结果表明,不同浓度的PGBL都可抑制A375细胞的增殖,且呈浓度、时间依赖性。证明PGBL对恶性黑色素瘤有一定的防治作用。

黄芩苷对人黑色素瘤A375细胞增殖的影响

目的:探讨黄芩苷对人黑色素瘤A375细胞株体外增殖的抑制作用。方法:选用人黑色素瘤A375细胞进行体外培养,以不同浓度的黄芩苷分别处理黑色素瘤A375细胞,连续6天使用倒置显微镜进行观察,计数,绘制生长曲线;以不同浓度(0.1～50μmol/L)的黄芩苷分别处理黑色素瘤A375细胞细胞24、48、72h后,用MTT法检测细胞生长抑制率;流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:生长曲线及MTT法显示黄芩苷对黑色素瘤A375细胞有抑制作用,并呈剂量和时间依赖性;流式细胞仪检测到细胞在黄芩苷作用后,细胞凋亡率增加。结论:黄芩苷对人黑色素瘤A375细胞具有明显抑制作用,细胞凋亡可能是其机制之一。

NF-κB抑制剂PDTC对人黑素瘤A375细胞增殖的影响

目的研究核转录因子-κB(NF-κB)特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲盐酸(PDTC)对人黑素瘤A375细胞的生长抑制作用。方法不同浓度的PDTC作用于A375细胞不同时间后,MTT法测定其对A375细胞增殖的抑制率,免疫细胞化学方法检测PDTC作用下A375细胞增生细胞核抗原(PCNA)的表达情况。结果经PDTC处理的实验组,肿瘤细胞增殖活性明显受到抑制(P<0.05,P<0.01),呈时间和剂量依赖性;与对照组相比,PDTC作用后A375细胞PCNA表达降低(P<0.01),且呈明显的剂量依赖关系。结论 PDTC具有显著抑制人黑素瘤A375细胞生长及PCNA表达的作用,是一种有潜力的抑制黑素瘤增殖的药物。

人脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1的三维培养及血管生成拟态机制的研究

目的通过体外三维培养人脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1,观察其生成血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)时,PI3K、Eph A2蛋白的表达,探讨VM发生的可能机制。方法体外三维培养OCM-1细胞,于三维培养7 d进行过碘酸-雪夫反应(periodic acid schiff reaction,PAS)染色,观察PAS阳性的环状结构的形成(即其形成VM的能力),于1 d、4 d、7 d进行PI3 K和Eph A2免疫组织化学染色并观察其结果。结果OCM-1细胞三维培养4 d,细胞大部分呈多角形,胞浆较丰富,核圆形,可见核仁,少部分肿瘤细胞长梭形,可见3~5个长梭形细胞彼此连接围成半环状结构。7 d后,肿瘤细胞几乎均变成长梭形,沿着胶原支架生长,细胞伸出长的突起,彼此之间相互接触围成环状结构。PAS染色可见瘤细胞大多呈弥散排列,肿瘤细胞模仿机体血管生成而形成瘤细胞条索并围成管道,一层细胞外基质(PAS阳性物质)围成环状结构。与培养1 d的细胞相比,培养4 d和7 d的PI3K和Eph A2蛋白表达量均明显增加(均为P<0.05),并随着时间的推移增加(7 d>4 d>1 d,P<0.05)。结论Eph A2和PI3 K可能在三维培养人脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1的VM形成过程中具有重要作用。

8株人黑色素瘤细胞系的建立及其生物学特性研究

目的 :从人黑色素瘤组织建立一系列黑色素瘤细胞系 ,命名为黑色素瘤细胞系 1- 8号 (HME1- 8) ,并研究鉴定其体外细胞生物学与免疫学特性。方法 :取黑色素瘤组织进行组织块培养法 ,待长满 90 %汇合面后消化传代培养 ,并进行形态学、生长动力学、免疫学及致瘤性等生物学特性研究。结果 :该系列黑色素瘤细胞系已在体外培养生存 1- 2年 ,传 6 0 - 10 0余代 ,其生物学特性显示 :①这些细胞系体外生长的倍增时间为 34. 2 - 5 9. 5h ;②软琼脂集落形成率平均值在 8. 6 % - 2 6 . 2 %之间 ;③接种至裸鼠后具有较高的致瘤性 ;④染色体核型分析为非整倍体 ,众数为 6 4 - 117条 ;⑤透射电镜下可观察到细胞含丰富的核糖体及黑色素颗粒 ;⑥免疫组化分析显示细胞浆内含大量阳性棕色黑色素颗粒 ;⑦肿瘤抗原检测显示 8株黑色素瘤细胞系的Melan -A抗原阳性率为 75 % ,MAGE - 1阳性率为5 0 % ,MAGE - 2阳性率为 37 .5 % ,MAGE - 3阳性率为 6 2 .5 %。结论 :8株黑色素瘤细胞系经体外长期培养后已永生化 ,形成了连续传代细胞系 ,具有明显的黑色素瘤细胞恶性表型特征。

人恶性黑色素瘤A375细胞黑素刺激素受体(MC1R)的检测

目的检测人恶性黑色素瘤A375细胞膜上MC1R蛋白及其cDNA,为研究黑色素瘤细胞表面受体及靶向配体奠定基础。方法利用放射配体分析法检测人恶性黑色素瘤A375细胞膜上的MC1R蛋白;用RTPCR方法扩增人恶性黑色素瘤A375细胞MC1R的cDNA,并克隆至pMD18T质粒,进行酶切分析鉴定及扩增片段DNA序列测定。结果放射配体分析结果表明,125IαMSH可与人恶性黑色素瘤A375细胞膜特异结合。RTPCR结果显示,扩增产物的大小与MC1R的cDNA相符。测序结果证实扩增片段为MC1R基因的特异片段。结论证实人恶性黑色素瘤A375细胞膜上表达MC1R蛋白。MC1R基因的成功克隆为其进一步研究提供了必要条件。

miR-214对人黑素瘤细胞A375增殖和侵袭及JNK1蛋白表达的影响

目的研究miR-214对人皮肤黑素瘤细胞系A375的增殖、侵袭及c-Jnk氨基末端激酶1(JNK1)表达的影响,探讨miR-214影响黑色素细胞增殖、侵袭的机制。方法将miR-214 mimics或inhibitor应用阳离子脂质体Lipofectamine^(TM)2000转染A375细胞,MTT和克隆形成实验分别检测转染后细胞增殖、侵袭能力的变化,Western blot方法检测JNK1蛋白表达。结果转染miR-214 mimics后,A375细胞增殖、侵袭能力明显降低,JNK1蛋白表达显著降低,(P<0.01);转染miR-214 inhibitor后,A375细胞增殖、侵袭能力明显升高,JNK1蛋白表达显著升高,(P<0.01)。结论 miR-214可能通过调控JNK1的表达抑制人黑素瘤细胞A375的增殖与侵袭能力。

大蒜生理活性物质对胃癌细胞和黑色素瘤细胞抑制作用的研究

目的:研究大蒜生理活性物质对人胃癌细胞MGC-9和小鼠黑色素瘤细胞B16细胞增殖及细胞周期的影响。方法:用倒置显微镜观察细胞形态,噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖抑制率;流式细胞仪检测B16细胞周期分布的影响。结果:经大蒜素及其前体物质蒜氨酸、蒜氨酸酶和蒜氨酸+蒜氨酸酶处理后,MGC-9和B16细胞不同程度变圆,体积缩小,脱壁细胞增多;除蒜氨酸酶外,蒜氨酸、大蒜素和蒜氨酸+蒜氨酸酶都能诱导MGC-9和B16产生时间和剂量依赖性的增殖抑制作用,其中蒜氨酸+蒜氨酸酶的作用尤为显著。大蒜素和蒜氨酸+蒜氨酸酶阻滞B16细胞于G0/G1期。结论:本文由大蒜提取物处理后结果与已发表的临床研究相一致。

人Bowes黑色素瘤细胞的培养液中组织型纤溶酶原激活剂的提纯

用大量培养人Ｂｏｗｅｓ黑色素瘤细胞的技术，在短期内获得了大量含组织型纤溶酶原激活剂ｔ－ＰＡ）的培养上清液。经ＳＰ－ＳｅｐｈａｄｅｘＣ５０柱分离及ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００柱凝胶过滤纯化。从１Ｌ培养上清液中可收获ｔ－ＰＡ０．１６ｍｇ。

人黑色素瘤细胞系基因突变的研究

目的 揭示金属蛋白酶类 (MMPs) ,层粘连蛋白受体 (LN R)与人黑色素瘤细胞侵袭转移的关系 ,并探讨MMPs ,LN R用以判断肿瘤细胞侵袭转移的可能性。方法 通过流式细胞术 (FCM )定量研究和蛋白酶活性分析 (zy mography) ,对具有不同潜在转移能力的人黑色素瘤细胞进行研究。 结果 早期WM 3 5不产生MMPs ;WM 13 4 1B仅产生MMP 2不产生MMP 9;进展期WM 983A和远处转移瘤株WM 45 1既产生MMP 2又产生MMP 9。瘤细胞表面67KDLN R的荧光阳性率和全部细胞的平均荧光强度大小顺序为WM 45 1>WM 983A >WM 13 4 1B >WM 3 5。结论 MMPs和LN R与人黑色素瘤细胞系的侵袭转移能力获得之间存在着密切关系 ,并可作为一种较特异的肿瘤侵袭转移标记物被应用于肿瘤研究与治疗中。