人CD59基因的突变和表达及其活性研究

目的: 构建人突变CD59(hmCD59)基因的真核表达系统, 深入研究hmCD59在糖尿病血管并发症中的作用。方法: 分别构建两种含有hmCD59全长cDNA序列的重组pALTER质粒, 运用脂质体介导法, 与pcDNA3质粒共转染CHO细胞, 以G418筛选阳性克隆(编号为hmCD59- 1- CHO及hmCD59 -2- CHO)。应用荧光抗体技术、免疫酶联技术及Westernblot, 进一步检测hmCD59蛋白在转染细胞膜表面的表达。通过双羧乙基碳氧荧光素四乙酰氧甲酯 (BCECF/AM)荧光染料释放试验, 对hmCD59蛋白糖基化前后的抗补体活性进行检测。结果: 筛选出的阳性克隆细胞用荧光抗体技术免疫酶联技术检测表明, 在细胞膜表面有hmCD59分子表达。将细胞的裂解物进行Westernblot证实, 在其相对分子质量(Mr)为 20 000处可见 1条与CD59的Mr相当的蛋白带。BCECF/AM荧光染料释放试验提示, 两种突变质粒的表达产物均具有抗补体活性, 糖基化后活性减弱。结论: 获得两株可稳定表达hmCD59的细胞。表达的hmCD59具有抗补体活性, 但糖基化后活性减弱。

真核细胞人突变CD59的纯化及初步鉴定

目的:获得人突变CD59(hmCD59)蛋白,为后续研究提供必要的材料。方法:运用脂质体介导法,将含有hmCD59全长cDNA序列的重组pALTER质粒与pcDNA3质粒共转染CHO细胞,以G418筛选阳性克隆,以免疫荧光技术和SDS-PAGE检测hmCD59的表达,表达产物经Anti-FLAGM2亲和凝胶纯化后,以SDS-PAGE、Western印迹和ELISA对纯化产物进行鉴定。结果:hmCD59蛋白在转染后的CHO细胞表面稳定表达。SDS-PAGE结果表明,纯化的hmCD59的相对分子质量同预期结果一致。Western印迹和ELISA证实,纯化的hmCD59蛋白具有与抗CD59抗体结合的活性。结论:获得了电泳纯的hmCD59蛋白,为进一步对其进行抗体制备、功能研究及临床应用奠定了基础。

人突变CD59的表达、纯化及抗原性鉴定

目的获得纯化人突变CD59(hmCD59)蛋白,制备其特异性抗体,对纯化产物进行鉴定。方法将含有hmCD59全长序列的重组pALTER质粒,运用脂质体介导法转染CHO细胞,采用SDS-PAGE检测hmCD59的表达情况,表达产物经ANTI-FLAG M2 Affinity Gel纯化后制备抗血清,以此抗血清鉴定纯化产物。结果hm-CD59在CHO细胞获得表达,ANTI-FLAG M2 Affinity Gel纯化后可获得电泳纯的hmCD59蛋白,hmCD59与小鼠抗hmCD59抗血清具有特异性反应。结论从真核细胞获得了电泳纯并具有抗原性的hmCD59蛋白,为进一步对其进行抗体制备、功能研究及临床应用奠定了基础。