为提升IPTR患者血小板输注后CCI值建立分级规避HLA抗体对应抗原方法及HLAMatchmaker的应用研究

目的:建立分级规避HLA抗体MFI阈值对应抗原方法,联合应用HLAMatchmaker表位计算法,选择供患者表位最小错配评分值,评估两种方法为免疫性血小板输注无效(Immune platelet transfusion refractoriness,IPTR)患者选择HLA相容性血小板供者,在提升血小板输注后校正增加值(CCI)的应用价值。方法:采用SPRCA法完成51例IPTR患者的7807次血小板交叉配型实验,判断其免疫反应阴/阳性结果。采用Luminex单抗原流式微珠法检测患者的HLA-I类抗体,获得不同特异性抗体对应HLA-I类抗原MFI值,并将其分组及分级,强阳性组(MFI>4000,1级)、中阳性组(1000中阳性组>弱阳性组)。强阳性和中阳性组与阴性对照组之间的SPRCA实验免疫反应阳性结果检出数存在统计学差异(P<0.001),弱阳性位组和阴性对照组之间的SPRCA实验免疫反应阳性结果检出数无统计学差异(P>0.05)。设置强阳性组为相应特异性HLA位点对应抗原1级规避阈值,中阳性组为2级规避阈值,弱阳性组为3级规避阈值,在供者血小板紧缺情况下,可以不需要规避弱阳性组。规避1和2级HLA-I类抗体对应供者抗原及选择HLAMatchmaker表位错配评分数≤7血小板供者策略,24 h内CCI值均>4.5×109/L,均可获得临床血小板输注有效。结论:在为IPTR患者选择HLA-I类相容性供者时,分级规避HLA-I类抗体对应供者抗原,综合选择供受者HLAMatchmaker表位错配评分数≤7,经血小板交叉配型实验确认为阴性结果的供者选择策略,对提升IPTR患者血小板计数具有一定实际应用价值。

贵阳地区血小板捐献者HPA-1~6/10/15/21和HLA-A/B基因多态性研究

目的研究贵阳地区机采血小板捐献者人类血小板抗原HPA-1~6/10/15/21及人类白细胞抗原HLA-A、B基因分布及多态性。方法采用实时荧光定量PCR法(qPCR)对287名贵阳地区机采血小板捐献者进行HPA-1~6/10/15/21和HLA-A、B基因分型,列举aa\ab\bb基因及HLA-A、B等位基因的分布情况、计算aa\ab\bb基因及HLA-A、B等位基因型频率。结果287名血小板捐献者HPA-1~6/10/15/21系统中,HPA-4和HPA-10的基因型均为aa型,不具有多态性;HPA-1,2,5,6和21主要以aa型为主;仅在HPA-3和HPA-15中检出bb型;杂合度最高的是HPA-15,HPA3杂合度居次;HLA-A位点检出14个等位基因,频率最高的3个是A*02(0.36)、A*11(0.33)和A*24(0.162;HLA-B位点检出23个等位基因,频率最高的4个是B*46(0.19)、B*15(0.149、B*40(0.14)和B*13(0.13)。结论贵阳地区机采血小板捐献者HPA-1~6/10/15/21和HLA-A、B基因存在多态性,需建立该地HPA/HLA基因分型血小板供者库服务于临床。

血小板HPA-3,HPA-15基因分型微滴式数字PCR检测体系的构建

目的建立血小板HPA-3,HPA-15基因分型的微滴式数字PCR(ddPCR)高灵敏检测方法,并初步探索应用于孕妇外周血胎儿游离DNA HPA抗原相容性检测的可行性。方法针对HPA-3,HPA-15的SNP突变位点,设计特异性引物及MGB探针,优化ddPCR退火温度及引物浓度等扩增条件,建立最佳反应体系,明确检验程序。对该检测方法进行方法学性能评估包括特异性、灵敏度、重复性和稳定性。利用ddPCR技术对2022年6月至2023年6月67例临床血液标本进行检测,将等位基因分型结果与基因测序结果比较,并对52例母体外周血胎儿游离DNA HPA抗原进行检测。结果检测血小板HPA-3,HPA-15的ddPCR方法,引物及探针特异性良好,HPA-3,HPA-15的最佳退火温度分别为:61.6℃,60.2℃;体系最佳引物浓度分别为:900 nM,700 nM;探针终浓度均为250 nM。拷贝数定量检测范围为:2~20000 copies,检测下限为0.1 copies/μL且线性良好。在低拷贝数标本中,HPA-3及HPA-15实际检测值的批内及批间变异系数(CV)均<5%。对67份人血液标本DNA的HPA-3,HPA-15基因型检测,结果与基因测序结果完全一致。应用于胎母血小板HPA-3,HPA-15基因型检测结果符合预期。结论本研究构建的HPA-3,HPA-15 ddPCR检测体系准确性高,重复性及稳定性较好,灵敏度高,可应用于临床血小板HPA-3,HPA-15基因型供者库的建立、基因配型及胎母血小板相容性检测等。

金华地区血小板献血者血小板基因的分型特点和基因库建设

目的研究金华地区血小板献血者人类白细胞抗原(HLA)-A、B位点和人类血小板抗原(HPA)-1~6、10、15、21位点的多态性分布特点并统计基因频率,初步建立起金华地区血小板基因库。方法对2020年1月至2021年2月金华市中心血站109名单采血小板献血者标本的HLA-A、B和HPA-1~6、10、15、21位点进行基因分型,计算基因频率,并与不同国家和地区进行比较,分析基因分布的差异性。结果109名金华地区血小板献血者共检出HLA-A位点等位基因14个,基因频率较高的等位基因分别是A*02、A*11、A*24、A*33;检出HLA-B位点等位基因24个,基因频率从高到低分别是B*40、B*15、B*46、B*58、B*55、B*39、B*13。金华地区的A*02、A*11、B*40、B*15、B*46等位基因的分布频率与西安、云南、河南、辽宁、淄博、广东等地相比,差异均有统计学意义(均P<0.05)。HLA-A、B位点基因分型结果均符合Hardy-Weinberg平衡(均P>0.05)。HPA-4a、10a呈单特异性,杂合度最高的基因型是HPA-3和HPA-15,经Hardy-Weinberg遗传平衡检验,发现金华地区HPA-1~3、6、15、21的基因频率符合遗传平衡法则,基因具备恒定性。金华地区与英国、美国相比,HPA-1、HPA-2、HPA-5、HPA-15基因频率差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论金华地区血小板基因库的建立有助于为血小板输注无效的患者提供HLA和HPA相对匹配的血小板制品,提高血小板输注效率。

HPA基因多态性和交互作用与新生儿血小板减少症的关联研究

目的探讨血小板特异性抗原(HPA)基因多态性和交互作用与新生儿血小板减少症(NT)的关联,为NT的发病机制研究提供实验依据。方法收集2022年01月至2023年10月在新生儿科住院治疗的NT患者105例为NT组,同期未诊断为NT的患儿124例为对照组,采集外周血,用扩增阻滞突变系统PCR(ARMS-PCR)法检测患儿HPA基因型,熔解曲线法分析扩增产物特异性。多因子降维分析(GMDR)软件GMDR 0.7评估HPA系统基因-基因交互作用在NT中的风险。结果NT组和对照组的妊娠合并症发生率、新生儿窒息发生率、血小板抗体阳性率差异有统计学意义(P<0.05);性别、出生体质量、胎龄、不良孕史、肺部感染、新生儿败血症、出血、凝血异常、黄疸等相关指标在两组分布无统计学意义(P>0.05);HPA1~6,15共七对等位基因位点频率分布在NT组和对照组中差异无统计学意义(P>0.05);HPA多态性1阶~7阶交互作用模型中第2阶(HPA-3,15)模型的均衡检验准确度(0.7821)最高,交叉验证一致性(10/10)最大,且有统计学意义(P=0.001)。3、4阶模型次之,均衡检验准确度为0.7695,交叉验证一致性为9/10,有统计学意义(P<0.05)。结论2阶、3阶、4阶交互作用有统计学意义。其中2阶模型的均衡检验准确度(0.7821)最高,交叉验证一致性(10/10)最大,HPA-3和HPA-15在NT的发生中存在交互作用。

血小板输注无效患者的HLA-Ⅰ类抗体特性分析

目的 分析血小板输注无效患者的HLA-Ⅰ类抗体特性。方法 本研究以65例血小板输注无效患者为对象。采用Luminex平台进行血小板相关抗体筛查和HLA-Ⅰ类抗体特异性鉴定。计算不同等位基因对应抗原的相对免疫原性。结果 65例标本有50例检出HLA-Ⅰ类抗体,且均包括HLA-A抗体和HLA-B抗体。河南汉族人群中HLA-A、B位点频率最高的等位基因A~*11:01和B~*13:02对应的抗体阳性率分别为0.33、0.65,相对免疫原性为0.1130和0.1838。而A~*34:01在河南人群的等位基因频率仅为0.0004,其对应抗原的相对免疫原性高达48.7953;同样,B~*44:02的等位基因频率仅为0.0001,其对应抗原的相对免疫原性高达127.4204。结论 HLA-Ⅰ类抗体对应抗原的免疫原性存在差异。通过分析抗体特性及抗原相对免疫原性可为患者选择合适供者,提高输注效果,预防新的抗体产生时提供数据支撑。

陕西地区血小板供者基因数据库拓展性应用的研究

目的通过分析本地区无偿献血与造血干细胞捐献群体之间的共性和特性,挖掘包括血小板基因供者库在内的无偿献血者与造血干细胞捐献者资料库间的融合潜力,提高招募成功率和已知结果库存率。方法应用数据库建模和比对方法对本市近10年无偿献血者与中华骨髓库陕西分库造血干细胞捐献者之间的匹配度和融合度进行筛选分层,采用Arlequin 3.5.2.2软件计算HLA、HPA基因频率及单体型频率,并根据表型频率计算不同血小板供者后备库中找到HLA、HPA全匹配供者概率。结果在本地区已入库造血干细胞志愿捐献者中,依据其献血行为挖掘出的活跃献血者分别划分为血小板供者库后备一、二、三、四梯队,分别为696名、2752名、9092名和12028名捐献者。第一梯队具有10~50次血小板捐献经历和10~20次全血捐献经历的占比最高,分别为13.65%和26.01%;第二梯队具有10~20次全血捐献经历和10~50次血小板捐献经历者占比分别为15.04%和1.38%,与其他梯队献血特征有差异(P<0.05)。在现有血小板库+一二梯队的核心库容中(n=4955),患者找到至少1名HLA-A,B表型相同的供者的概率可达69.02%;当考虑到ABO和HPA同型时,找到至少1名HLA、HPA全相合且ABO同型供者概率(B型为例)为48.73%。结论西安地区全血捐献、单采血小板捐献和造血干细胞捐献这3类群体存在较大交叉分布性,与从头开始扩充库容相比,造血干细胞捐献者资料库中的活跃献血者是血小板供者库的后备有声力量,在扩大有效库容的同时能够最大限度降低建库成本和资源需求。

长沙地区血小板供者基因数据库理论建模分析

目的分析长沙地区血小板供者基因数据库建设情况,评估为临床提供HLA/HPA匹配的单采血小板的可能性。方法分析长沙地区血小板供者基因数据库1029例无亲缘关系单采血小板供者HPA、HLA⁃A/B等位基因及抗原分布情况,评估长沙地区血小板供者基因数据库建设规模。结果在不考虑ABO血型的情况下,当库容为207人时,约有95%的患者能在该库中找到至少1名HPA基因型全匹配的供者;当库容为2127人时,约有95%的患者能在该库中找到至少1名HLA⁃A/⁃B表型匹配的供者;当库容为1029人时,约有79.25%的患者能在该库中找到至少1名HLA⁃AB表型匹配的供者。单采血小板捐献者A、B抗原CREG表位不配合的概率最高分别为1C⁃2C和7C⁃5C,Broad CREG不配合概率最高的为4C⁃6C。结论长沙地区已建立已知HLA/HPA基因型的血小板供者基因数据库库容1029人,在扩大有效库容的同时将进一步验证理论建模的适用性和匹配概率的符合性。

基于序列的多重聚合酶链反应对献血者HLA/HPA基因分型

目的研究嘉兴地区献血者HLA-I类(A、B位点)和HPA基因表达情况,建立本地区血小板基因数据库。方法采用基于序列的多重聚合酶链反应(multiplex PCR-SBT)对嘉兴地区5,411例样本进行HLA-I类(A、B)基因测序,对其中199例单采血小板献血者样本进行HPA1-6、15、21w系统基因分型,统计分析HLA-I类和HPA1-6、15、21w基因频率分布情况。结果5,411例样本中共检出HLA-A、B位点等位基因53种,其中HLA-A位点等位基因15个,频率前5位为A*2(0.3040)、A*11(0.2384)、A*24(0.1771)、A*33(0.0893)、A*30(0.0493);HLA-B位点等位基因38个,频率前5位为B*46(0.1137)、B*60(0.1136)、B*13(0.0931)、B*62(0.0822)和B*58(0.0820)。HPA1~6、15、21w系统均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律,具有恒定性,以HPA-3杂合度(a/b杂合子基因型)最高(0.482),其次为HPA-15(0.437),HPA-3、15系统中a、b抗原频率相近,HPA-3、15系统有b/b纯合子基因型,分别为0.196,0.266。其余5个系统均以a/a纯合子基因型为主,分别为0.995、0.8995、0.990、0.975、0.945,未见b/b基因型。结论HLA-A、B位点和HPA3、15系统基因具有多态性分布特点,建立献血者HLA/HPA基因数据库可有效解决血小板输注无效问题。

血小板HLA⁃Ⅰ类抗体与输注效果的相关性

目的分析血小板人类白细胞抗原(HLA)⁃Ⅰ类抗体与输注效果的相关性。方法选择2021年10月至2022年10月期间西部战区总医院收治的62例血小板输注无效(PTR)患者,选取同期60例血小板输注有效患者为对照组,比较两组血小板HLA⁃Ⅰ类抗体阳性检出率、输注后校正血小板增高指数(CCI)、血小板回收率(PPR),以PTR为因变量、以血小板HLA⁃Ⅰ类抗体为协变量绘制ROC曲线,分析血小板HLA⁃Ⅰ类抗体对PTR的预测效果,并分析血小板HLA⁃Ⅰ类抗体与CCI、PPR的相关性。结果PTR组血小板HLA⁃Ⅰ类抗体阳性检出率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。PTR组输注后1 h、24 h的CCI和PPR均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。血小板HLA⁃Ⅰ类抗体预测PTR的曲线下面积(AUC)为0.815(95%CI:0.735~0.880),敏感度、特异度为85.45%、77.61%。经Spearman相关检验,血小板HLA⁃Ⅰ类抗体与输注后1 h、24 h的CCI和PPR均呈负相关(P<0.05)。结论血小板HLA⁃Ⅰ类抗体在患者中明显阳性表达,对PTR发生发展有一定预测价值,且血小板HLA⁃I抗体与输注后1 h、24 h的CCI和PPR呈负相关,对血小板HLA⁃Ⅰ类抗体阳性表达患者采取对应措施有望降低PPR发生率。

献血者血小板1-16抗原基因遗传多态性分析及已知HPA型供者数据库的建立

本研究的目的是分析人类血小板抗原(humanplateletantigen,HPA)基因多态性,根据分布频率来判断HPA抗原不配合比率以及抗体产生的机会,确定有临床意义的血小板抗原系统,并建立邯郸地区血小板基因频率数据库和供者库。采用SSPPCR方法对邯郸地区148名随机献血者进行HPA116抗原32个等位基因的检测分析,并与不同人群的分布频率进行比较。结果表明:每个样本均检测到HPA1a、2a、4a14a、16a基因;HPA4a、7a14a、16a呈现单态性,未检测出相应的等位基因HPAb;对于HPA1、2、5、6主要以a/a纯合子为多,a/a基因型频率分别是0.9595、0.8108、0.9865、0.9797,没有b/b纯合子出现。在HPA116中,具有最高杂合度的是HPA15,基因型HPA15a/15a、HPA15a/15b、HPA15b/15b频率分别是0.2230、0.5270、0.2500;HPA3在其次,基因型HPA3a/3a、HPA3a/3b、HPA3b/3b频率分别是0.3851、0.5135、0.1014。经χ2检验,结果符合HardyWeinberg遗传平衡定律。邯郸地区随机献血者HPA15系统基因频率与石家庄地区相似(P>0.05);与我国台湾人群进行HPA113、HPA15的比较,HPA1、2、6具有明显的不同(P<0.05),其它相似(P>0.05);与韩国人群进行HPA18的比较,除HPA3具有明显不同外(P<0.05),其余均相似(P>0.05);与美国黑人进行HPA15的比较,HPA1、2、5具有明显的差异(P<0.05);与英国人进行HPA111的比较,HPA1、5具有明显的不同(P<0.05)。结论:北方地区中国人群HPA2、3、5、15系统具有多态性,且HPA抗原分布不配合比率较高,这必然造成免疫暴露的机会增加,提示在临床上可能具有重要的免疫学意义。同时,在此次研究数据的基础上建立了邯郸地区血小板基因频率数据库和血小板已知型供者库。

中国汉族人群人类血小板抗原HPA-15(Gov)多态性调查

目的研究中国汉族人群人类血小板抗原HPA15(Gov)系统多态性,评估其在血小板配型输注中的作用。方法采用PCRSSP技术对1000名来自不同省份汉族无关献血者进行HPA15系统基因分型。结果HPA15在所调查的7个省份汉族人群中的分布差异无显著性意义,在1000名汉族中HPA15a和15b基因频率分别为0.5320和0.4680,与HardyWeinberg平衡吻合;与其它种族的HPA15分布相比较,也无显著性差异。在随机输血中HPA15a和15b抗原不配合的机会分别为0.1711和0.2029。结论本调查数据表明,随机输血中供受者HPA15抗原不配合比例在中国汉族人群中高达37%,这对研究同种免疫血小板减少症和开展血小板同型输注具有指导意义。

广州地区汉族人群人类血小板同种抗原及HLA-Ⅰ抗原基因分型库的建立

目的建立广州地区汉族人群人类血小板抗原(HPA)1—6、9及15系统和HLA-Ⅰ抗原基因分型库,探讨其基因多态性的分布,为有效避免血小板输注同种免疫的发生提供实验基础。方法随机抽取广州地区无血缘关系的健康机采血小板无偿献血者(均为汉族)的血样805份,采用PCR-SSP方法做HPA-1—6、9及15系统基因分型,利用Luminex-SSO方法做HLA-A、B、Cw抗原分型。结果HPA的基因频率分别为HPA-1a0.998、1b0.002,2a0.952、2b0.048,3a0.553、3b0.447,4a0.999、4b0.001,5a0.976、5b0.024,6a0.982、6b0.018,9a1.000、9b0.000,15a0.518、15b0.481;HPA-3、15a/b对偶抗原有aa、ab和bb 3种表型,HPA-1、2和4—6未发现bb表型,HPA-9未发现ab、bb表型;HPA-3a、3b,15a、15b的不配合率最高。经χ2检验,实验结果符合Hardy-Weinberg遗传定律。HLA-Ⅰ抗原基因频率较高的表达有A*02 0.286A*240.162A*11 0.323B*46 0.147B*75 0.100C*01 0.177C*03 0.289C*07 0.179。结论广州地区汉族HPA-1—6、9及15系统基因频率分布和HLA-Ⅰ类抗原分布存在明显的多态性,与其它资料相比显示出种族和地域性差异;建立HPA-1—6、9及15系统和HLA-Ⅰ抗原基因分型库对于临床输血有重要意义。

山东汉族人群血小板抗原基因多态性分析

目的:探讨山东汉族人类血小板抗原(human platelet antigen,HPA)1-17、人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)A、B多态性分布。方法:对山东地区962位无血缘关系的汉族血小板自愿捐献者采用PCR-SSP方法进行HPA1-17系统的基因分型,采用PCR-SSOP技术对HLA-A、B位点进行基因分型,直接计数法计算基因频率,HPA1-17及HLA基因型组合用Arelequin 3.5进行分析。结果:HPA各等位基因频率分别是1a:0.9918,1b:0.0082,2a:0.9419,2b:0.0592,3a:0.5841,3b:0.4174,4a:0.9969,4b:0.0031,5a:0.9892,5b:0.0108,6a:0.9835,6b:0.0175,7-14a:1,7-14b:0,15a:0.5488,15b:0.4512,16a:1,16b:0,17a,17b:0;频率最高的HPA基因组合型为:HPA-(1,2,4,5,6,7-14,16,17)aa-3ab15ab(0.2048);HLA-A、B位点中频率最高的基因分别为A*2(0.3094)、B*13(0.1513),频率最高的HLA基因组合型为:HLA-A*02~B*13(0.1397)。结论:山东汉族人群HPA和HLA分布具有明显多态性,与其他人群相比显示出地域和种族性差异,应建立本地区的血小板捐献者HPA和HLA分型资料库。

山东汉族人群血小板特异性抗原基因的多态性研究

目的 研究山东汉族人群血小板特异性抗原（HPA）1～5和15系统基因多态性分布特点。方法 采用PCR-序列特异性引物（PCR-SSP）技术对234例无血缘关系，汉族，血小板志愿捐献者进行HPA-1～5和HPA-15系统基因分型，计算等位基因频率、基因型频率并与其他种族、地区人群相关资料比较。结果 等位基因频率由高到低依次为HPA-4a、-1a、-5a、-2a、-3a、-15a、-15b、-3b、-2b、-5b、-1b，未检到HPA-4b。基因型频率由高到低依次为HPA-4a4a、-1a1a、-5a5a、-2a2a、-15a15b、-3a3b、-3a3a、-15a15a、-363b、-15b15b、-2a2b、-5a5b、-1a1b，未检到HPA-1b1b、-5b5b和HPA-2b2b。与报道的东方人群比较，有显著性差异的系统有HPA-2、-3,-5（P〈0．005）；与西方人群比较，HPA-1、-2、-3、-5系统有显著性差异（P〈0．005），HPA-4无种族间显著性差异。HPA-15系统的基因分布与越南、德国、奥地利人近似，而与印地安人有较大差异（P〈0．005）。结论 HPA存在明显的种族和地域性差异。山东汉族人发生HPA同种免疫的可能风险抗原基因主要有HPA-3a，-3b，-2b，-5b，-1b，其次为HPA-15a、-15b。