A panel of monoclonal antibodies against the prion protein proves that there is no prion protein in human pancreatic ductal epithelial cells

Prion diseases are a group of neurodegenerative diseases that are fatal. The study of these unique diseases in China is hampered by a lack of resources. Amongst the most important resources for biological study are monoclonal antibodies. Here, we characterize a panel of monoclonal antibodies specific for cellular prion protein by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), immunofluorescent staining, flow cytometry, and western blotting. We identify several antibodies that can be used for specific applications and we demonstrate that there is no prion protein expression in human pancreatic ductal epithelial cells(HPDC).

三种哺乳动物朊蛋白基因的克隆与分析

以外周血液的总DNA为模板,运用PCR方法克隆了汉族人、秦川黄牛和甘肃土种绵羊的Prnp基因,运用分子生物学软件对这些序列进行了分析比较。结果表明,获得的3种哺乳动物的Prnp基因均位于1个单一的外显子内,与GenBank中登录的相应序列具有高度同源性,达99.0%。牛与绵羊Prnp基因同源性为97.3%,推导氨基酸序列同源性为96.5%。人Prnp基因与黄牛和绵羊Prnp基因的同源性分别为86.7%和87.1%,其氨基酸序列的同源性均为90.0%。3种Prnp基因均有富含G-C的重复区,编码的PrP蛋白均由氨基端的信号肽、中间的成熟蛋白和羧基端的GPⅠ锚结合位点组成。基因型分析表明,秦川黄牛和甘肃土种绵羊可能存在感染海绵状脑病的风险。

人朊蛋白基因的克隆与原核表达

以人血液中提取的总DNA为模板,克隆朊蛋白(prion protein,PrP)基因Prnp户的开放阅读框(ORF),与pMD -18T载体连接后转入E．coli JM109,用Blast软件比较重组质粒序列,结果表明获得的人Prnp的ORF与Genbank登录的相应核苷酸序列最高同源性为99．6％,推导的氨基酸序列同源性为99．8％,将编码人成熟PrP的基因定向克隆到 pET-30a(+)表达载体,将重组质粒pET-homPrP转化E．coli BL21(DE3),在37℃下用1．0 mmol／L IPTG诱导,重组融合蛋白获得高效表达,SDS-PAGE显示表达产物以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的20％～25％．用Ni-NTA 树脂亲和层析纯化了表达产物．Western-blotting分析表明,融合蛋白被抗PrP的单克隆抗体特异识别．因此,在大肠杆菌中表达的人成熟PrP融合蛋白可以作为制备PrP抗体的免疫原．

人类朊蛋白的动力学稳定性研究（英文）

朊蛋白病是一种能在人类或者动物之间传播的致命的神经退行性疾病.尤其是人类朊蛋白疾病在近几年蔓延迅速,已经威胁到人类的健康.在本文中,我们使用分子动力学(MD)和流体分子动力学(FMD)模拟相结合的方法研究了人类朊蛋白(hPrPc)的动力学稳定性.我们通过FMD模拟产生了两个典型的hPrPc的变性结构,并进一步研究了在自然状态下这两个变性结构重折叠的过程,从关键残基、二级结构、残基-残基相互作用图等方面详细讨论了hPrPc的解折叠和重折叠路径.研究发现hPrPc的三个α-螺旋结构组成了一个疏水核心,在蛋白质的解折叠和重折叠过程中发挥了重要的作用.刚性的疏水核心就像是脚手架一般为hPrPc的重折叠提供便利.在重折叠过程中,π-螺旋和310螺旋出现几率较高,并且β-折叠的延长也更多地出现在完全解折叠的hPrPc体系中.

人成熟叠朊在大肠埃希菌中高效表达

以含有人叠朊编码基因Prnd的ORF的质粒HoPrnd-T为模板,PCR扩增出成熟叠朊编码基因片段homDpl,并将其插入原核表达载体pGEX-6P-1的EcoRⅠ和XhoⅠ位点之间,构建出重组表达质粒pGEX-homDpl。将pGEX-homDpl电转化到宿主菌株BL21(DE3)中,以1.0 mmol/LIPTG诱导表达,SDS-PAGE结果显示人成熟叠朊被大肠埃希菌高效表达。

人类朊蛋白稳定性的流体分子动力学研究（英文）

朊蛋白病,被称为传染性海绵状脑病(TSE),或者致死性神经退行传染病,在人和动物中发病,与α-螺旋构型部分向β-折叠构型转变有关.本文使用分子动力学模拟和流体分子动力学模拟相结合的方法对野生型人类朊蛋白和R200K突变型人类朊蛋白的结构稳定性进行了研究.研究发现,α-螺旋柱交叉形成的防护墙是维持朊蛋白结构稳定的关键因素,而β-折叠活性较高.流体动力干扰在一定程度上可以不改变折叠路径并能够有效加速蛋白质的解折叠过程.

VZV对Schwann细胞朊蛋白糖基化的影响及甲钴胺的调节作用

目的探究水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)对人Schwann细胞(human Schwann cells,hSC)朊蛋白(cellular prion protein,PrPC)糖基化特征的影响,及甲钴胺(methylcobalamin,MeB12)的调节作用。方法以感染复数1.0的VZV感染细胞48 h,加入250μg/ml的MeB12培养48 h,用抗体3F4分别包被上清和沉淀中PrPC,凝集素-ELISA法筛查PrPC的糖基化特征,并测定上清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性与丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。结果VZV感染组细胞上清与沉淀中的PrPC聚糖比例与未感染组比较有明显变化,总聚糖比分别为1∶1.5和1∶2.6(F=24.18,P<0.001,LSD-t=8.27,P<0.001),提示VZV感染后PrPC稳定性下降,相应的SOD活性(4.43±2.05 U/mg)与未感染组(14.23±1.27 U/mg)比较明显下降(F=18.19,P=0.001,LSD-t=6.54,P<0.001),MDA水平(11.17±1.89 nmol/mg)与未感染组(3.73±0.35 nmol/mg)比较明显升高(F=30.70,P<0.001,LSD-t=8.25,P<0.001),差异均有统计学意义。加入MeB12后,VZV感染细胞沉淀中的聚糖较VZV感染未加药组有明显增加,总聚糖比为1∶2.4,提示MeB12增强了PrPC的稳定性,相应地SOD活性明显增高(11.07±2.07 U/mg,LSD-t=4.42,P=0.002),MDA水平明显下降(5.23±0.96 nmol/mg,LSD-t=6.58,P<0.001),与感染未加MeB12组比较差异有统计学意义。结论VZV可改变hSC中PrPC的糖基化特征,而MeB12可调节PrPC的糖基化特征,增强PrPC的稳定性,从而提高hSC的抗氧化能力。

2014—2017年北京市西城区克-雅病监测病例特征分析

目的了解2014—2017年北京市西城区克-雅病(Creutzfeldt-Jakob Disease,CJD)监测病例的流行病学特征、临床特点及转归情况。方法对2014—2017年北京市西城区医疗机构报告的可疑CJD病例的临床信息、流行病学、实验室检测结果以及随访资料进行分析。结果 2014—2017年北京市西城区共报告监测病例261例,支持CJD诊断的有80例,其中散发型克-雅病(sCJD)疑似诊断病例35例,sCJD临床诊断病例44例,遗传型克-雅病(gCJD)确诊病例1例,另外还有5例诊断为致死性家族型失眠症(FFI)。病例首发症状主要为快速进行性痴呆,临床表现根据出现频率高低依次进行性痴呆(100%)、锥体/锥体外系症状(76.47%)、视觉或小脑功能障碍(48.23%)、肌阵挛(43.53%)、无动性缄默(21.18%)和其他(31.76%)。辅助检查以头颅核磁共振(MRI)异常征象为主,实验室检测脑脊液14-3-3蛋白阳性率较高(51.76%,44/85),人类朊蛋白基因(PRNP)检测发现6例基因突变。病例流行病学特征分析显示发病时间、地区和职业均呈散在性。对所有诊断病例进行随访,有35例失访,失访率41.18%。结论 2014—2017年北京市西城区监测到的CJD病例以散发型为主,流行病学特征与2008—2013年的监测情况大致相同,定期随访有助于CJD正确诊断。