腺苷A_(2B)受体激活减轻脓毒症诱导的急性肺损伤及肺微血管内皮炎症损伤

目的分析腺苷A_(2B)受体(A_(2B) R)激活对脓毒症诱导的急性肺损伤(ALI)的影响并探讨其在肺微血管内皮炎症损伤中的调控作用。方法(1)将24只SD大鼠随机分为假手术组(sham组)、ALI模型组(ALI组)、A_(2B) R激动剂BAY60-6583干预组(ALI+BAY组)和A_(2B) R抑制剂PSB1115干预组(ALI+PSB组),每组6只。制模后24 h处死大鼠取肺组织,光镜下行肺损伤评分(Smith评分),计算肺湿/干质量比值(W/D)。Evans Blue染色法测定肺水清除率(AFC)。酶联免疫吸附试验(ELISA)测定肺组织炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)的水平。(2)采用TNF-α诱导人肺微血管内皮细胞(HPMECs)损伤模型,设立对照组、TNF-α组、BAY组、PSB组、BAY+TNF-α组和PSB+TNF-α组,各组细胞培养24 h后采用异硫氰酸荧光素(FITC)-白蛋白(albumin)法检测HPMECs单层通透性,Werstern blot法检测IL-1β、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管内皮钙黏连蛋白(VE-cadherin)、促血管生成素(ANGPT)的表达水平。结果与sham组比较,ALI组的Smith评分、肺W/D及肺组织TNF-α、IL-6、IL-1β水平均显著升高,AFC显著降低;与ALI组比较,ALI+BAY组的Smith评分、肺W/D及肺组织TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著降低,AFC显著升高;而ALI+PSB组结果相反。TNF-α诱导HPMECs损伤模型中,与对照组比较,TNF-α组IL-1β、ICAM-1表达水平及HPMECs单层通透性升高,VE-cadherin、ANGPT表达水平降低。与TNF-α组比较,BAY+TNF-α组IL-1β、ICAM-1表达水平及HPMECs单层通透性降低,VE-cadherin、ANGPT表达水平升高,而PSB1115预处理可逆转上述现象。上述各组之间差异有统计学意义(均P<0.05)。结论腺苷A_(2B) R激活可减轻脓毒症诱导的ALI,并通过减轻肺微血管内皮炎症、降低通透性、促进血管生成等途径起保护作用。

半夏多糖对脂多糖诱导人肺微血管内皮细胞损伤的保护作用

目的探讨3种半夏(姜半夏、清半夏和法半夏)多糖(PSPR)对脂多糖(LPS)诱导的人肺微血管内皮细胞(h PMEC)炎症损伤的保护作用。方法以水提醇沉法提取PSPR;体外培养的h PMEC同时加入LPS 1 mg·L^(-1)+PSPR 100和400 mg·L^(-1)孵育24 h。CCK-8法测定细胞存活率,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定肿瘤坏死因子α(TNF-α),白细胞介素1β(IL^(-1)β),IL-6和IL-8释放,用Western蛋白质印迹法检测细胞IL-8和细胞间黏附分子1(ICAM-1)的表达,实时定量PCR技术分析IL-8和ICAM-1 m RNA水平。结果与溶剂对照组相比,LPS 1 mg·L^(-1)损伤组细胞存活率显著降低(P<0.01);与LPS 1 mg·L^(-1)损伤组相比,3种PSPR 100和400 mg·L^(-1)能有效缓解LPS诱导的细胞存活率下降(P<0.01),抑制LPS诱导的TNF-α,IL^(-1)β和IL-6释放(P<0.01),抑制LPS诱导的IL-8和ICAM-1蛋白表达增加(P<0.01)及IL-8和ICAM-1 m RNA水平增加(P<0.01)。结论 3种PSPR对LPS诱导的h PMEC炎症损伤有一定的保护作用,其机制可能与抑制TNF-α,IL^(-1)β和IL-6等促炎因子的释放有关;PSPR还可抑制IL-8和ICAM-1的表达,有助于缓解IL-8和ICAM-1引起的中性粒细胞趋化作用。

肝细胞生长因子对缺氧损伤的肺微血管内皮细胞的保护作用

目的探讨肝细胞生长因子(HGF)对缺氧损伤的人肺微血管内皮细胞(HPMECs)的保护作用,提高肺血管内皮细胞对缺氧的耐受性,增加损伤后的存活率,改善其功能,为防止缺氧导致的肺动脉高压提供实验依据。方法体外培养HPMECs,用物理方法建立缺氧损伤模型。实验分为空白对照组、缺氧损伤组、HGF组、PHA665752组(HGF抑制剂组)。采用免疫荧光法鉴定第7代HPMECs,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率,倒置显微镜下计数在不同干扰条件下HPMECs的贴壁细胞数量,Western blot法检测细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达情况。结果缺氧损伤组细胞贴壁率下降,ICAM-1的表达量明显高于空白对照组(P<0.01);HGF组细胞存活率较缺氧损伤组明显提高(P<0.01),细胞贴壁率较缺氧损伤组明显增加(P<0.01),ICAM-1的表达量明显下降(P<0.01);PHA组细胞存活率较缺氧损伤组和HGF组均有明显差异(P<0.01),细胞贴壁率较缺氧损伤组明显下降(P<0.01),ICAM-1的表达明显上升(P<0.01)。结论 HGF可能是通过增加HPMECs的存活率、提高体外培养时细胞的贴壁率、减少ICAM-1表达,减轻缺氧损伤所造成的HPMECs损伤。

人胎盘胎儿来源间充质干细胞通过旁分泌肝细胞生长因子减轻脂多糖诱导的人肺微血管内皮细胞损伤

目的探讨无血清培养人胎儿来源胎盘间充质干细胞(hfPMSC)旁分泌肝细胞生长因子(HGF)对脂多糖(LPS)诱导内皮细胞损伤的保护作用。方法用无血清培养基培养hfPMSC,流式细胞术检测CD73、 CD90、 CD105、 CD14、 CD34、 CD45、 HLA-DR的表达以确定其干细胞属性;利用Transwell^(TM)共培养体系[人肺微血管内皮细胞(HPMEC)接种于Transwell^(TM)上室, hfPMSC接种于下室],检测hfPMSC旁分泌HGF对LPS处理的HPMEC通透性的影响。实验分为LPS处理组、 hfPMSC共培养组、 HGF中和抗体组、正常HPMEC对照组。在Transwell^(TM)培养上室加入100μg异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(FITC-dextran),荧光酶标仪检测染料渗透情况; Western blot法检测渗透相关蛋白血管内皮钙黏素(VE-cadherin)和陷窝蛋白1(caveolin-1)及凋亡相关裂解型蛋白胱天蛋白酶3(c-caspase-3)和裂解型多腺苷二磷酸核糖聚合酶1(c-PARP1)的蛋白水平。结果所培养细胞具备间充质干细胞形态,为CD73、 CD90、 CD105阳性及CD14、 CD34、 CD45、 HLA-DR阴性细胞;与LPS处理组相比, hfPMSC共培养可显著抑制LPS环境中HPMEC的通透性,显著上调VE-cadherin的表达水平,降低caveolin-1、 c-caspase-3和c-PARP1的蛋白水平。相反,中和共培养体系中的HGF,可逆转hfPMSC对HPMEC的上述作用。结论 hfPMSC通过分泌HGF抑制LPS诱导的HPMEC通透性增加。

细胞间黏附分子-1在ARDS小鼠肺微血管内皮细胞内的表达变化

目的细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）在介导中性粒细胞肺部浸润的过程中起到很大作用。在脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）诱导的急性呼吸窘迫综合征小鼠模型中,观察ICAM-1以及丝裂原激活蛋白激酶2（mitogen-activated protein kinase activated protein kinase 2,MK2）和人抗原R（human antigen R,HuR）在小鼠肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cell,PMVEC）内表达的变化。方法健康清洁型6~8周雄性C57BL/6小鼠,随机数字表法分为对照组和LPS组,每组5只。LPS组腹腔注射LPS 5 mg/kg（溶于100μL的PBS中）,对照组腹腔注射PBS（5mg/kg）,24 h处死全部小鼠。在LPS诱导的小鼠ARDS模型中,用Real-time PCR方法检测小鼠肺组织分离得到的PMVEC内人抗原R（human antigen R,HuR）、ICAM-1的mRNA表达量,用Western blot法检测总MK2、磷酸化MK2、HuR以及ICAM-1表达量的变化,利用流式细胞仪检测PMVEC表面ICAM-1的表达量及肺部浸润的中性粒细胞数量。结果 LPS组小鼠肺组织W/D较对照组高,差异有统计学意义[（6.16±0.40）vs（3.61±0.28）,P〈0.05]。流式细胞术检测LPS组中性粒细胞浸润率较对照组高[（13.92±3.23）%vs（3.24±1.24）%,P〈0.05]。LPS刺激后小鼠肺组织中ICAM-1的mRNA及蛋白表达较对照组明显增加（P〈0.05）,PMVEC表面ICAM-1表达较对照组也明显增加（P〈0.05）。MK2总量无明显变化,磷酸化MK2较对照组明显增加,HuR mRNA及蛋白总量无明显变化,但存在核质转移。结论特异性阻断或减少微血管内皮细胞中HuR的表达可使ICAM-1表达减少,从而减少中性粒细胞的浸润,减轻ARDS病理生理改变,可为临床治疗ARDS提供一个新靶点。

脂多糖对人肺微血管内皮细胞骨架及TNF-α和IFN-γ表达的影响

目的探讨脂多糖(LPS)直接诱导人肺微血管内皮细胞(HPMVEC)后细胞骨架的改变,肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)mRNA的表达及细胞培养上清液中TNF-α、IFN-γ的表达水平的改变。方法 HPMVEC生长至80%以上融合时,加入LPS以500 ng/mL浓度刺激细胞分别至0、4、6、8 h,经鬼笔环肽染色后采用激光共聚焦显微镜观察HPMVEC细胞骨架的变化。至预定时相点离心收集培养液上清液,利用实时荧光定量RT-PCR法检测TNF-α、IFN-γmRNA的表达,采用ELISA方法测定细胞培养上清液中TNF-α、IFN-γ的表达水平,并进行统计学分析。结果 LPS刺激培养后,8 h组细胞开始出现细胞骨架改变;4 h组TNF-α、IFN-γmRNA表达与0 h组差异无统计学意义(P>0.05),6 h组TNF-α、IFN-γmRNA表达高于0 h组(P<0.05),8 h组TNF-α、IFN-γ表达高于0 h组(P<0.05);4 h组细胞培养上清液TNF-α、IFN-γ的表达水平与0 h组比较差异无统计学意义(P>0.05),6 h组细胞培养上清液TNF-α、IFN-γ的表达水平高于0 h组(P<0.05),8 h组细胞培养上清液TNF-α、IFN-γ的表达水平高于0 h组(P<0.05)。结论细菌致病因子LPS能直接刺激HPM-VEC使细胞结构发生改变,同时影响细胞因子的分泌,使促炎因子TNF-α和IFN-γ分泌升高,参与肺损伤。这可能是LPS发挥其毒性作用诱发急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的一个重要途径。

前列地尔对缺氧损伤的人肺微血管内皮细胞中VEGF和eNOS表达的影响

目的:研究前列地尔对缺氧损伤的人肺微血管内皮细胞(HPMECs)中血管内皮生长因子(VEGF)和内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)表达的影响。方法:将HPMECs分为A组(正常培养)、B组(3%O_2培养)、C组(3%O_2培养+15μg/L前列地尔)及D组(3%O_2培养+45μg/L前列地尔),相应培养24 h。观察各组细胞形态,MTT比色法检测细胞活力(以吸光度计),流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot法检测细胞中VEGF、eNOS相对表达量。结果:A、D组细胞密度较高,B、C组细胞密度较低。与A组比较,B、C、D组细胞活力降低、凋亡率升高、VEGF与eNOS表达增强、eNOS/VEGF减少(P<0.05)。与B组比较,C、D组细胞活力增加、VEGF表达减弱(P<0.05);D组细胞凋亡率降低、eNOS表达减弱、eNOS/VEGF增加(P<0.05)。与C组比较,D组细胞凋亡率降低、VEGF表达减弱、eNOS/VEGF增加(P<0.05)。结论:前列地尔可能通过上调HPMECs的eNOS/VEGF发挥保护作用。

脓毒症血清对人肺血管内皮细胞损伤的实验研究

目的:探讨严重脓毒症血清损伤人肺血管内皮细胞(PMVECs)的机制。方法:随机将离体培养PMVECs分为3组:正常培养组(N组)加入10%胎牛血清、健康组(H组)加入10%健康人血清、患者血清组(S组)加入10%严重脓毒症患者血清,分别于刺激0、1、2、4、6 h MTT比色法检测PMVECs增殖活性,测定吸光度(OD);免疫组化观察NF-κB表达,测定平均光密度(AOD);透射电镜观察细胞超微结构;比较不同时相3组PMVECs上述指标变化。结果:各组不同时间点PMVECs的OD值有差异(P<0.01),OD值的变化趋势有差异(P<0.01)。与N组及H组相比,S组1 h OD值明显降低(P<0.01),随患者血清刺激时间延长,S组OD值维持在较低水平。NF-κB免疫组化检测示S组1 hAOD值达高峰,后逐渐下降(0.523±0.012,0.498±0.009,0.444±0.030)。透射电镜示N组与H组电镜下未见明显亚显微结构变化,S组1 h可见PMVECs微绒毛减少,内质网扩张,WPBs小体减少,6 h可见PMVECs胞膜断裂,微绒毛消失,线粒体呈空泡性变,核周隙增宽,胞间可见囊泡状改变。结论:严重脓毒症患者血清可损伤离体PMVECs,NF-κB活化可能是严重脓毒症致急性肺损伤的一个重要环节。

血管紧张素Ⅱ对人肺微血管内皮细胞核因子-κB的活化作用

目的探讨不同浓度血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)在不同时间点对人肺微血管内皮细胞(HPMEC)核因子-κB(NF-κB)的活化作用。方法采用原代培养的HPMEC,分别以浓度为10-8、10-7、10-6、10-5mol.L-1的AngⅡ刺激HPMEC0、0.5、1、2、4 h,用凝胶电泳迁移率实验(EMSA)观察NF-κB对DNA的结合活性。结果各浓度组AngⅡ均能活化HPMEC中NF-κB;与0 h比较,AngⅡ10-8mol.L-1组在4 h表现出明显的NF-κB活化作用(P<0.05),AngⅡ10-7mol.L-1组在1 h开始活化NF-κB(P<0.05),随后各时间点的效应逐渐增强;AngⅡ10-6mol.L-1组在1 h开始活化NF-κB(与0 h比较,P<0.05),2 h时达到高峰(与1 h比较,P<0.05),4 h活化水平下降(与2 h比较,P<0.05);AngⅡ10-5mol.L-1组在0.5 h即明显活化NF-κB(与0 h比较,P<0.05),随后各时间点NF-κB活化效应逐渐减弱。结论AngⅡ刺激HPMEC后能引起NF-κB活性增加,这可能是AngⅡ促炎作用的重要环节。

热休克蛋白A12B对脂多糖诱导肺微血管内皮细胞损伤的影响

目的探讨小鼠肺微血管内皮细胞(mPMVECs)热休克蛋白A12B(HSPA12B)表达下调对脂多糖(LPS)诱导的细胞炎症反应、迁移及超微结构改变的影响。方法体外传代培养的mPMVECs分为LPS组(添加1μg/mL LPS)、LPS+siRNA组[瞬时转染法将HSPA12B相应基因片段干扰小RNA(siRNA)寡核苷酸转入mPMVECs中,再加入1μg/mL LPS)]和LPS+NC组[瞬时转染法将平行对照(NC)siRNA寡核苷酸转入mPMVECs中,再加入1μg/mL LPS]。对LPS+siRNA组和LPS+NC组,分别采用Transwell试验和细胞划痕实验观察细胞迁移情况;应用透射电子显微镜(透射电镜)观察mPMVECs超微结构改变;应用Real-Time PCR检测各组细胞中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、IL-10和IL-1βmRNA的表达。结果与LPS+NC组比较,LPS+siRNA组mPMVECs的线粒体损伤加重,内质网水肿更明显;细胞内TNF-α、IL-6和IL-10mRNA的表达显著上调(P<0.05),而IL-1β表达下调,但差异无统计学意义(P>0.05);细胞迁移功能显著下降(P<0.05)。结论下调HSPA12B表达后,mPMVECs经LPS刺激的炎症反应增强,细胞迁移功能下降。HSPA12B可能参与保护mPMVECs免受LPS侵袭的过程。

低氧联合TNF-α通过激活STAT3而非ERK1/2途径介导人肺微血管内皮细胞凋亡

目的探讨低氧联合肿瘤坏死因子α(TNF-α)介导人肺微血管内皮细胞(HPMVEC)凋亡的信号通路。方法低氧6、12、24 h及(10、20、50、100)ng/m L TNF-α分别处理HPMVEC,使用MTT比色法检测各组的细胞活性;选用最佳的低氧时间及TNF-α剂量联合刺激HPMVEC,流式细胞术检测caspase-3的活性,异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)检测各组细胞的凋亡情况,采用Western blot法检测各组细胞中磷酸化信号转导子与转录因子3(p STAT3)及磷酸化胞外信号调节激酶1/2(pERK1/2)的水平。结果 MTT法显示,低氧24 h组的相对细胞活性最低,100 ng/m L TNF-α处理组的相对细胞活性明显降低且对细胞活性的抑制呈现剂量依赖性;选用低氧24 h及100 ng/mL TNF-α作为联合处理组,与空白对照组及单独处理组相比,联合处理组的caspase-3活性及细胞凋亡率均升高。Western blot结果显示,与空白对照组相比,联合处理组的p STAT3表达明显升高,而p ERK1/2的变化无统计学意义。而STAT3通路阻断剂S3I-201可使联合处理组的细胞凋亡率下降。结论低氧状态联合TNF-α通过激活STAT3而非ERK1/2介导HPMVEC凋亡。

丹酚酸A对脂多糖诱导人肺微血管内皮细胞线粒体自噬和细胞损伤的影响

目的:探讨丹酚酸A(SalA)对脂多糖(LPS)诱导的人肺微血管内皮细胞(HPMVECs)线粒体自噬和细胞损伤的影响。方法:采用终浓度为10μg/m LLPS构建细胞损伤模型,并将实验分为对照组、SalA组、LPS组、LPS+SalA组。采用噻唑蓝染色法分析细胞增殖情况,流式细胞技术检测细胞内活性氧(ROS)含量和线粒体膜电位水平,蛋白免疫印迹法检测微管相关蛋白轻链3(LC3)-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、PTEN介导的假定激酶蛋白1(PⅠNK1)和Parkin蛋白相对表达量。结果:10μg/m LLPS呈时间依赖性抑制HPMVECs的增殖;LPS+SalA组细胞相对存活率高于LPS组,低于对照组(P<0.05)。LPS组ROS含量(283.96%±10.88%)增高,膜电位水平(38.25%±5.69%)降低,与对照组(100%)相比差异有统计学意义(P<0.05);LPS+SalA组ROS含量(138.76%±11.82%)低于LPS组,线粒体膜电位水平(76.56%±6.22%)高于LPS组(P<0.05)。LPS组细胞LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、PⅠNK1和Parkin蛋白表达量较对照组增高(P<0.05),LPS+SalA组LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、PⅠNK1和Parkin蛋白相对表达量低于LPS组(P<0.05);LPS组线粒体PⅠNK1和Parkin蛋白表达量与对照组比较增高(P<0.05),LPS+SalA组明显低于LPS组(P<0.05)。结论:SalA减轻LPS诱导的HPMVECs细胞细胞损伤作用,其可能机制与其降低细胞内ROS,稳定线粒体膜电位,抑制线粒体自噬有关。

TNF-α诱导人肺微血管内皮细胞凋亡Caspase-3活性的研究

目的探讨凋亡"核心蛋白酶"-半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导人肺微血管内皮细胞(HPMVECs)凋亡中的作用。方法体外培养HPMVECs,空白对照组置于CO2培养箱中常规培养,TNF-α组分别以10 ng/m L、20 ng/m L、50 ng/m L、100 ng/m L浓度刺激HPMVECs,使用MTT比色法检测各组细胞活性,AnnexinⅤ/PI双染色联合流式细胞术检测细胞凋亡率,流式细胞术检测Caspase-3的活性。结果空白对照组的细胞凋亡率及Caspase-3活性最低;空白对照组和TNF-α组(10 ng/m L、20 ng/m L、50 ng/m L)比较,100 ng/m L TNF-α组的相对细胞活性最低,而细胞凋亡率及Caspase-3活性最高,TNF-α诱导HPMVEC凋亡时呈现出浓度依赖性,随着时间的延长,Caspase-3活性逐渐升高(P<0.05)。结论 TNF-α诱导人肺微血管内皮细胞凋亡呈现浓度依赖性,Caspase-3可能参与了这一细胞凋亡过程的调控。

氧糖剥夺/复氧所致细胞焦亡在肺微血管内皮细胞损伤中的作用

目的:探讨氧糖剥夺/复氧(OGD/R)是否导致人肺微血管内皮细胞(HPMVECs)焦亡及其在细胞损伤中的作用。方法:采用HPMVECs复制OGD/R细胞模型,模拟体外循环中HPMVECs缺血/再灌注过程。将细胞分为对照(control)组(正常培养)、OGD/R组(OGD 8 h+恢复12 h)及VX-765(caspase-1抑制剂)组(在OGD/R之前4 h给予50μmol/L VX-765处理,其余培养条件同OGD/R组)。采用RT-qPCR和Western blot法检测caspase-1、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)及含caspase募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的mRNA及蛋白表达水平;采用ELISA法检测上清液中白细胞介素1β(IL-1β)及IL-18水平;采用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测上清液中LDH的水平。结果:与control组比较,OGD/R组caspase-1、NLRP3和ASC的mRNA和蛋白表达均升高(P<0.05),炎症因子IL-1β和IL-18分泌均增多(P<0.05);使用VX-765可逆转OGD/R造成的caspase-1、NLRP3和ASC mRNA和蛋白表达水平的上调及IL-1β和IL-18的分泌(P<0.05),同时下调OGD/R后的LDH水平(P<0.05)。结论:OGD/R可导致HPMVECs发生焦亡,抑制细胞焦亡可缓解OGD/R对HPMVECs的损伤。

肾上腺髓质素对高氧肺损伤的保护作用研究

目的通过观察不同实验条件下肾上腺髓质素(adrenomedullin,ADM)对人肺微血管内皮细胞中降钙素受体样受体(calcitonin receptor-like receptor,CRLR)、受体活性修饰蛋白2(receptor activity-modifying proteins,RAMP2)、细胞外信号调节激酶(extracellular regulatedkinase,ERK)与蛋白激酶B(protein kinaseB,PKB)表达的影响,从而探讨ADM在高氧肺损伤过程中的作用。方法将人肺微血管内皮细胞随机分为空气组及高氧组(各组n=3),高氧组细胞置于3 L/min 92%O_(2)+5%CO_(2)高纯混合气中培养;应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应和Western blot法分别检测ADM、CRLR、RAMP2、ERK1/2和PKB的mRNA及其蛋白表达水平。另取细胞分为未干扰组和干扰组(n=3),向干扰组细胞转染ADM siRNA后,检测ADM、ERK1/2、PKB的mRNA及其蛋白表达水平。结果与空气组相比,高氧组ADM、CRLR、RAMP2、ERK1/2、PKB的mRNA及其蛋白表达量均显著增高(P<0.05)。与未干扰组相比,干扰组ADM、ERK1/2、PKB的mRNA及其蛋白表达量均显著降低(P<0.05)。结论ERK1/2、PKB可能为ADM信号通路下游靶点,ADM通过调控CRLR/RAMP2介导ERK/PKB信号通路,共同参与高氧肺损伤的保护过程。

人羊膜匀浆上清液对脂多糖致伤的大鼠肺微血管内皮细胞增殖及分泌炎症因子的影响

目的：探讨人羊膜匀浆上清液（hAHS）对脂多糖（LPS）致伤的大鼠肺微血管内皮细胞（RPMVECs）增殖及其分泌促炎因子的影响。方法：用新鲜人羊膜制备hAHS,用考马斯亮蓝法和ELISA法分别测定hAHS中总蛋白和表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、白介素-4（IL-4）、IL-10、血管生成素-1（Ang-1）、人β-防御素2（HBD2）的含量。MTT法检测不同体积分数hAHS（0、10%、15%、20%、25%）作用于RPMVECs后细胞增殖活性的变化,确定hAHS促进RPMVECs增殖的最佳浓度。根据共培养条件不同,将RPMVECs随机分为4组：N组（10%FBS＋DMEM/F12）,A组（10%FBS＋DMEM/F12＋15%hAHS）,B组（10%FBS＋DMEM/F12＋LPS）和C组（10%FBS＋DMEM/F12＋15%hAHS＋LPS）。各组细胞在干预后0、12、24、48、72h用MTT法测定吸光度值（A值）,并分别于培养6、8、10、12、24h时用ELISA法测定RPMVECs培养上清液中TNF-α、IL-6、IL-8的含量。结果：hAHS中总蛋白浓度为（725.125±12.625）mg/L,其中EGF、bFGF、VEGF、IL-4、IL-10、Ang-1、HBD2的浓度分别为（504.785±4.665）、（4.426±0.138）、（0.185±0.006）、（25.650±4.104）、（13.733±2.197）、（15.561±0.496）和（4.763±0.714）ng/L。hAHS的体积分数在10%~20%时均具有促进RPMVECs增殖的作用且以15%hAHS培养后第7、9天的增殖率最佳,而25%hAHS在第7、9、11天使RPMVECs增殖率小于0%hAHS组（P〈0.05）。A组48和72h细胞增殖活性较N组显著增加,B组24、48和72h的增殖活性较N组显著降低;C组24、48和72h的增殖活性较B组显著升高（P〈0.05）。ELISA结果显示,B组各时间点的IL-6和TNF-α的含量以及8、10、12和24h的IL-8含量均显著高于N组（P〈0.05）;C组10和12h的IL-6含量,8、10、12和24h的IL-8含量及各时间点的TNF-α含量均显著低于B组（P〈0.05）。结论：hAHS含有促进组织修复、调节免疫反应、降低血管通透性及杀伤致病微生物的多种生长因子、细胞因子,对LPS致伤的RPMVECs增殖具有促进作用,并减少致伤后炎症因子分泌。

MiR-206通过靶向调控notch3参与香烟烟雾诱导的人肺微血管内皮细胞凋亡

目的探讨miR-206在香烟烟雾提取物(CSE)诱导人肺微血管内皮细胞(HPMECs)凋亡中的分子作用机制。方法实时定量PCR检测相关基因的表达水平;Western blot检测相关蛋白的表达水平;流式细胞技术检测细胞凋亡;萤光素酶实验验证miR-206与下游基因的结合位点。结果不同浓度的CSE (0.5%～5.0%)处理能够促进HPMECs凋亡的同时增加miR-206的表达水平(P<0.05)。MiR-206过表达促进HPMECs的凋亡,同时提高cleaved caspase-3和caspase-9蛋白水平(P<0.05);而miR-206低表达可以抑制CSE引起的HPMECs凋亡以及凋亡相关蛋白(cleaved caspase-3和caspase-9)表达的上调(P<0.05)。生物信息学分析以及萤光素酶实验结果证实miR-206可以通过作用于notch3 3'非翻译区从而抑制notch3的表达。进一步的营救实验发现,notch3过表达可以拮抗miR-206引起的HPMEC凋亡。结论 MiR-206在CSE处理的HPMECs中表达上调,miR-206低表达对CSE引起的凋亡起到抑制作用,这种作用可能是通过靶向调控notch3来实现的。

P38MAPK在低氧及炎症联合刺激诱导人肺微血管内皮细胞凋亡中的作用

目的探讨P38MAPK在低氧及炎症联合刺激诱导人肺微血管内皮细胞凋亡中的作用。方法将人肺微血管内皮细胞株进行复苏及传代培养,分为空白对照组、低氧组(低氧6 h、12 h、24 h)、肿瘤坏死因子(TNF-α)刺激组(用10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml的TNF-α进行刺激)、模型组(低氧24 h+TNF-α100 ng/ml联合刺激)及通路阻断剂组(加入通路阻断剂SB203580进行干预)。Western-blot法分析各组细胞中P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)表达,流式细胞术分析各组细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活力,流式细胞术和TUNEL法联合检测细胞凋亡。结果与空白对照组相比,模型组p-P38MAPK表达升高(P<0.05)。与低氧组(24 h)、TNF-α刺激组(100 ng/ml)相比,模型组(低氧24 h+TNF-α100ng/ml联合刺激)细胞活力均下降(P均<0.01);与模型组相比,通路阻断剂组细胞Caspase-3活力下降(P<0.01)。与模型组相比,通路阻断剂组细胞凋亡率及凋亡指数均下降(P<0.01)。结论 P38MAPK在低氧及炎症联合刺激诱导的人肺微血管内皮细胞中具有促凋亡作用,P38MAPK通路阻断剂对低氧及炎症联合刺激损伤的人肺微血管内皮细胞具有保护作用。

人胎盘间充质干细胞来源的外泌体通过增强细胞自噬减轻脂多糖诱导的肺血管内皮细胞损伤

目的探讨人胎盘间充质干细胞来源的外泌体(hPMSC-exs)对脂多糖(LPS)诱导的人肺微血管内皮细胞(HPMEC)损伤的影响及可能的机制。方法体外扩增培养hPMSC,收集细胞培养上清,ExoQuick外泌体提取和纯化试剂盒分离、纯化上清液中hPMSC-exs。透射电镜观察外泌体形态特征,Western blot法检测外泌体表面特异性标志物CD9、CD63的表达。构建hPMSC与HPMEC非接触共培养体系,实验分为对照组、LPS损伤组、hPMSC组和hPMSC-exs组。共培养12 h后,检测各组上室渗透到下室中的异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(FITC-dextran)荧光强度以确定单层肺血管内皮的通透性;1,1′-十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸酯(DiI)标记hPMSC-exs并在荧光显微镜下观察对损伤内皮的迁移作用;CCK-8法检测各组上室细胞增殖水平;线粒体膜电位检测试剂盒检测各组上室内皮细胞线粒体膜电位;Western blot法检测下室HPMEC自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、beclin-1的蛋白表达。结果获得的hPMSC-exs直径在30~120 nm,CD9、CD63表达阳性,符合hPMSC-exs表型特征;与LPS损伤组相比,hPMSC组及hPMSC-exs组FITC-dextran荧光强度值降低,LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增加、beclin-1蛋白表达上调,细胞增殖率提高。与hPMSC组相比,hPMSC-exs组荧光显微镜下内皮细胞间连接大致完整、FITC-dextran荧光强度值、内皮细胞增殖率、线粒体膜电位、LC3-Ⅱ/Ⅰ比值及beclin-1表达水平均无明显变化。结论hPMSC-exs可减轻LPS诱导的HPMEC损伤,改善细胞内线粒体功能,其作用机制可能与增加HPMEC自噬有关。

泮托拉唑对急性肺损伤模型大鼠和人肺微血管内皮细胞损伤的作用及作用机制

目的探讨泮托拉唑对急性肺损伤(ALI)模型大鼠和人肺微血管内皮细胞(HPMECs)损伤的作用及作用机制。方法将48只SD大鼠随机分为正常对照组,脂多糖组,阳性对照组,泮托拉唑低、高剂量组和泮托拉唑高剂量+氯喹组,各8只。除正常对照组外,其余各组大鼠均腹腔注射5 mg/kg脂多糖复制ALI模型;阳性对照组大鼠腹腔注射2 mg/kg地塞米松,泮托拉唑低、高剂量组分别腹腔注射泮托拉唑26,104 mg/kg,泮托拉唑高剂量+氯喹组注射104 mg/kg泮托拉唑和10 mg/kg氯喹,正常对照组和脂多糖组大鼠均腹腔注射等体积生理盐水。取对数生长期的HPMECs,随机分为正常对照组,脂多糖组,阳性对照组,泮托拉唑低、高剂量组和泮托拉唑高剂量+氯喹组。除正常对照组(给予等体积生理盐水)外,其余各组细胞添加100μg/mL脂多糖,以构建HPMECs损伤模型,阳性对照组添加100 nmol/L地塞米松,泮托拉唑低、高剂量组细胞分别添加泮托拉唑40,80μg/mL,泮托拉唑高剂量+氯喹组添加80μg/mL泮托拉唑和5μmol/L氯喹。采用苏木精-伊红染色法检测大鼠肺组织的病理学变化,测定肺组织湿/干重比值(W/D);采用TUNEL染色法检测大鼠肺组织细胞凋亡情况;采用酶联免疫吸附法检测肺组织和HPMECs细胞中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)水平;采用CCK-8法检测细胞活性;采用蛋白免疫印迹法检测肺组织和HPMECs细胞中LC3、Beclin1、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)的表达水平。结果与脂多糖组比较,阳性对照组,泮托拉唑低、高剂量组大鼠肺组织病理学评分、W/D值均显著降低(P <0.05),大鼠血清和HPMECs细胞中TNF-α,IL-6,IL-1β水平均显著降低(P <0.05),TUNEL阳性细胞数均显著减少(P <0.05),细胞凋亡率和p-mTOR/mTOR表达水平均显著降低(P <0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1表达水平均显著升高(P <0.05)。结论泮托拉唑可通过mTOR信号通路调控自噬,在ALI模型大鼠和HPMECs损伤中发挥保护作用。