人血清白蛋白和干扰素α2b融合蛋白在毕赤酵母中表达及质量控制

筛选获得毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K/hsa-ifnα2b,胞外分泌表达rHSA-IFNα2b药物蛋白。经摇瓶及5 L发酵罐条件优化,确定最佳发酵条件。经50 L发酵罐工艺放大,发酵产量稳定,可达到350 mg/L。离心获得发酵上清液,超滤浓缩10倍,再依次通过Blue Sepharose 6FF亲和层析、Phenyl Sepharose 6FF疏水层析及Q Sepharose 6FF离子柱纯化。纯化产品进行SDS-PAGE纯度检测、SEC-HPLC检测、相对分子质量测定、N端测序、内毒素检测和生物活性检测。筛选获得一株高产菌,优化获得最佳的发酵条件。纯化产品检测(SEC-HPLC)纯度大于95%,相对分子质量为85 821,氨基酸的N端测序为DAHKSEVAHRFKDLG,与预期的相符。内毒素含量小于5EU/mg,符合国家药典的要求。体外生物细胞活性高达1.6×106IU/mg。具有良好的工业应用价值。

重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白在PichiaPink系统中的表达

目的:比较PichiaPink表达系统和巴斯德毕赤酵母GS115在表达外源蛋白方面的差异,对PichiaPink表达系统的潜在优点进行评价。方法:以重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白(HSA-IFN-α2b)为报告蛋白,构建相关载体,分别转化PichiaPink系统菌株和巴斯德毕赤酵母GS115菌株,诱导HSA-IFN-α2b表达并测定表达水平;通过SDS-PAGE检测HSA-IFN-α2b在PichiaPink系统中的降解程度。结果:PichiaPink系统几乎所有的转化子都可以表达HSA-IFN-α2b,而GS115菌株只有60%的转化子能表达HSA-IFN-α2b;同一种Pink菌株中,整合有高拷贝数表达载体pPink-HC的菌株表达量高于整合有低拷贝数表达载体pPink-LC的菌株;Pink蛋白酶缺陷菌株在复杂培养基(YPD,BMMY)中HSA-IFN-α2b基本没有降解,而在合成培养基(BSM)中降解现象明显。结论:PichiaPink表达系统产生的转化子较GS115菌株产生的转化子易于筛选;PichiaPink系统蛋白酶缺陷菌株可明显减少外源蛋白降解。这些结果为利用PichiaPink表达系统高水平和大规模制备外源蛋白提供了实验依据。

重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白中聚乙二醇1500残余量测定方法研究

目的:探讨重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白中聚乙二醇1500(PEG1500)残留量的检测方法。方法:选择3个不同批次重组人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白原液作为供试品,采用聚乙二醇残余量测定法,参照药品质量标准分析方法验证指导原则,分别设计专属性、线性范围、准确性、精密性、定量限实验进行测定。结果:该实验方法专属性、准确性、精密度及5.05~50.50μg/mL范围的线性关系良好,定量限为1.94μg/mL。结论:该实验方法用于人血清白蛋白与干扰素α-2b融合蛋白原液的PEG1500残余量检测,结果准确、可靠。

人白介素2-人血清白蛋白融合蛋白的纯化及活性鉴定

采用课题组已构建的携带人白介素2-人血清白蛋白融合蛋白(rhIL-2-HSA)基因的重组毕赤酵母Pichia pastoris GS115进行rhIL-2-HSA的分离纯化研究。发酵上清液经超滤浓缩、Blue Sepharose亲和层析、Octyl Sepharose疏水层析和DEAE Sepharose离子交换层析纯化获得较高纯度的目的产物,SDS-PAGE检测为单一条带。Western Blot分析结果显示,目的产物同时具有HSA和IL-2的抗原性,为HSA和IL-2的融合分子。经CTLL-2/MTT细胞增殖法测定,纯化的融合蛋白的生物学活性为1.147×107 IU/mg。

人血清白蛋白-白介素-2融合蛋白在CHO细胞中的表达

白细胞介素-2在人体免疫应答中具有重要作用,常用于治疗肿瘤、肝炎和免疫缺陷性疾病等多种疾病,但因其体内半衰期短而限制了其临床应用。文中构建了含有融合蛋白基因HSA-IL-2的p MH3质粒,并通过电转染的方法转入中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO细胞)中,利用p MH3质粒所携带的neo基因进行筛选,经96孔板培养并筛选得到稳定表达目的蛋白质的重组细胞,融合蛋白HSA-IL-2表达量达到2.26 mg/L。利用反转录PCR和Western blot对重组细胞鉴定后发现,融合蛋白编码基因整合入重组CHO细胞基因组中,而且融合蛋白同时具有HSA和IL-2双重免疫原性。利用对IL-2具有依赖性的CTLL-2细胞进行活性分析后发现,筛选得到的表达细胞分泌得到的融合蛋白具有较高的生物活性,表明成功构建具有表达IL-2生物活性能力的CHO细胞。

注射用重组人血清白蛋白与干扰素α2b融合蛋白稳定性研究

目的考察制品注射用重组人血清白蛋白与干扰素α2b融合蛋白的稳定性。方法按照《中国药典》2015年三部的方法进行检测,影响因素试验[(42±2)℃高温试验、(4 500±500)Lx强光照射试验、90%高湿试验]、加速试验(37℃加速试验与25℃加速试验)及长期稳定性试验,方法均按照《生物制品稳定性研究技术指导原则》进行。结果影响因素试验、加速试验及长期试验结果显示,温度对于本制品的纯度有一定的影响,随着试验温度越高,制品纯度变化越快,保存时间越短;湿度对制品的水分也有影响,其他指标相对稳定;通过长期稳定性考察发现,制品的试验样品在2~8℃密闭储存条件下保存24个月是相对稳定的,且各项考察指标均符合质量检定标准。结论本制品注射用重组人血清蛋白与干扰素α2b融合蛋白在2~8℃密闭储存条件下保存24个月,各项考察指标保持稳定,且均符合质量检定标准。

重组人血清白蛋白-干扰素α2a融合蛋白质控方法与质量标准的建立

目的:建立重组人血清白蛋白-干扰素α2a融合蛋白(rHSA-IFNα2a)的质控方法和质量标准。方法:分别使用抗HSA抗体和抗IFNα2a抗体、采用免疫印迹法对成品进行鉴别试验,采用WISH细胞病变抑制法测定成品和原液的生物学活性,原液以胰蛋白酶酶切后,用HPLC分析肽图,其余项目按2010年版中国药典(三部)的规定进行检测。结果:样品与抗HSA抗体和抗IFNα2a抗体均呈阳性反应,比活性>1.5×105 IU.mg-1,其肽图与参考品的一致,其余项目均符合2010年版中国药典(三部)的规定,根据检测结果建立了rHSA-IFNα2a的质量标准。结论:建立的质控方法和质量标准可以保证rHSA-IFNα2a的安全、有效和质量可控,可以用于rHSA-IFNα2a的常规检定。

共表达蛋白二硫键异构酶对IFNβ-HSA融合蛋白在毕赤酵母中表达的影响

目的探讨共表达蛋白二硫键异构酶(PDI)对干扰素β与人血清白蛋白(IFNβ-HSA)融合蛋白在毕赤酵母中表达的影响。方法根据GenBank公布的毕赤酵母PDI序列设计引物,利用PCR方法从毕赤酵母基因组中扩增目的基因片段,插入表达载体pPICZαA,并整合入融合蛋白(IFNβ-HSA)基因工程菌中,筛选共表达PDI的重组酵母菌,甲醇诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物,ELISA法检测IFNβ-HSA的表达量。结果经PCR鉴定,重组表达质粒pPICZαA-PDI已转入毕赤酵母KM71/pPIC9K-IFNβ-HSA中。经SDS-PAGE分析,PDI在菌体内大量表达,原始菌株和共表达菌株均明显表达融合蛋白IFNβ-HSA,共表达PDI菌株表达量提高了60%,ELISA法测定达(22.49±3.52)mg/L。结论共表达PDI能促进外源蛋白的分泌表达,为进一步研究在毕赤酵母中过量表达分子伴侣对其分泌外源蛋白的影响奠定了基础。