Dynamical analysis for hybrid virus infection system in switching environment

We investigate the dynamical behavior of hybrid virus infection systems with nonlytic immune response in switching environment, which is modeled as a stochastic process of telegraph noise and represented as a multi-state Markov chains. Firstly, The existence of unique positive solution and boundedness of the new hybrid system is proved. Furthermore, the sufficient conditions for extinction and persistence of virus are established. Finally, stochastic simulations are performed to test and demonstrate the conclusions. As a consequence, our work suggests that stochastic switching environment plays a crucial role in the process of virus prevention and treatment.

肝炎患者血清TT病毒核酸检测及分析

目的:证实在不明原因的肝炎患者血清中一种新型病毒(TTV)的存在,分析其感染特征。方法:用地高辛素标记基因探针,斑点杂交法检测未知和已知病原的肝炎患者75例,正常对照17例。结果:92例血清TTVDNA总检出率为23.91%(22/92)。其中非甲～非戊型肝炎病人组检出率为35%(7/20),甲～戊肝组21.81%(12/55),正常对照组17.65%(3/17);急性肝炎中36.84%(7/19),慢性肝炎中21.88%(7/32),重症肝炎中40%(2/5),肝硬化中15.79%(3/19)。结论:TT病毒可能是导致病毒性肝炎的一种新型病原,可以单独感染或与其他病毒重叠感染,亦可有健康携带状态。感染后出现急性慢性甚至重度肝损伤。

乙肝病毒突变位点的寡核苷酸与肽核酸阵列杂交检测

目的:比较利用寡核苷酸阵列和肽核酸阵列检测乙肝病毒突变位点。方法:针对乙肝病毒常见的1762A-T与1764G-A联合突变、1858C-T、1896G-A 3个突变位点,设计寡脱氧核苷酸和肽核酸检测探针,探针经固定后分别与不对称PCR荧光标记的靶DNA杂交,扫描分析荧光信号强度,DNA序列分析3位点的变异情况。结果:对于寡核苷酸芯片,1762与1764联合位点、1858以及1896位点的野生型探针与突变探针荧光强度的比值分别为1.44、1/1.24、1.05。对于肽核酸芯片,相应位点的野生型探针与突变探针荧光强度的比值分别为2.8、1/3.02、1.71。DNA序列分析结果表明该样本中1858位点为突变位点,1896以及1762与1764联合位点不存在突变。结论:与寡脱氧核苷酸探针相比,肽核酸与靶DNA杂交结合能力和识别单碱基错配能力均高于相应的寡脱氧核苷酸,二者杂交结果与测序结果一致。

喉乳头状瘤临床行为与细胞增殖活性关系的研究

利用ISH方法以及免疫病理手段对不同型的LP组织的标本进行PCNA、P53检测，探讨不同型HPV与LP的发生发展的相关机制，以寻求有效的检测方法帮助临床对LP的预后进行评估。标本选自1994年1月～1995年12月间我院收治的LP共36例。ISH法HPV6b／11阳性率为75％，明显高于HPV16和／或HPV18的表达。10例喉鳞癌各有1例HPV16、18阳性，无HPV6b／11阳性。ABC法行P53检测，36例LP标本中仅1例恶变组织阳性表达Ⅱ级（2．8％）；10例喉鳞癌中9例阳性表达（90．0％），其中Ⅱ级以上阳性表达6例（60．0％）。PCNA阳性表达27／36例（75％）；其中JOP组与AOP组阳性率有显著差异（P＜0．05）。本研究表明LP与HPV感染有极为密切的关系，认为HPV分型的检测在判断LP转归中有意义。PCNA阳性表达程度在预测LP肿瘤的活跃程度方面是一个很有意义的指标。P53蛋白表达在喉鳞癌与LP中有显著差异。

病毒性肝炎发病机制相关基因克隆化的研究策略

乙型肝炎病毒 (HBV)和丙型肝炎病毒 (HCV)感染引起病毒性肝炎的发病机制目前还有许多方面没有研究清楚。以肝炎病毒相关的新基因克隆化为主要目的的研究是病毒性肝炎发病机制研究领域中创新知识的重要源泉。病毒基因的复制和表达受到肝细胞中蛋白质因子的调节 ,肝炎病毒基因编码的蛋白与肝细胞中的蛋白能够结合 ,这种相互作用对于肝细胞正常的信号转导过程产生显著影响 ,肝炎病毒蛋白在肝细胞中的表达对于肝细胞的基因表达谱产生影响 ,也可能是病毒性肝炎、肝细胞癌 (HCC)发病机制中的主要机制。酵母单杂交技术、酵母双杂交技术、基因芯片技术、抑制性消减杂交技术、噬菌体展示技术、蛋白质分离纯化与基因克隆化的反向遗传学技术等 ,在肝炎病毒基因调控、肝炎病毒蛋白结合蛋白的研究、肝炎病毒蛋白反式激活靶基因的研究中都有重要的应用 ,是促进慢性病毒性肝炎发病机制研究、探索病毒性肝炎新型治疗技术和治疗方法的有效途径和手段。

生物素标记cDNA探针杂交检测梨树上3种潜隐病毒研究

本研究合成了苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)和苹果茎痘病毒(ASPV)的生物素标记cDNA探针,对斑点杂交和免疫印迹杂交检测这3种病毒的效果进行了分析。以含ACLSV和ASGV克隆片段的大肠杆菌菌液为样品时,斑点杂交检测灵敏度分别为80 cfu/μL和50 cfu/μL。以离体培养砂梨植株为材料,采用斑点杂交法检测砂梨离体培养植株粗提液中的3种病毒,均产生强的杂交信号,且特异性好。比较斑点杂交和ELISA检测病毒含量相对较低的热处理再生植株中ASGV和ACLSV,结果表明斑点杂交具有较高的灵敏度。组织印迹杂交检测砂梨离体植株ASGV和ACLSV的结果显示,这2种病毒在离体植株的各部位均有分布,自基部至茎尖各部位印迹均产生很强的杂交信号。

混合网络入侵特征的高效分类模型研究与仿真

对混合网络病毒入侵特征的准确分类是实现入侵病毒有效检测的基础,传统的分类模型采用C-均值聚类算法,不适应于混合网络入侵病毒的非线性特征分类。提出一种基于信息熵聚类的混合网络入侵特征的高效分类模型。构建混合网络的入侵信号模型,进行信息熵特征提取,设计优化聚类算法实现高效分类。仿真结果表明,采用该算法,能准确实现对入侵病毒的特征分类,避免对病毒入侵特征的错分和漏分,提高了对网络病毒的准确检测能力。

Ⅰ型单纯疱疹病毒基因探针的制备及应用

本文从克隆化的HSV-1 EcoRI-H片段重组菌株中分离重组质粒DNA。经酶切、低熔点琼脂糖凝胶电泳分离出目的基因HSV-1 EcoRI-H片段DNA(13.5Kb)。用缺口翻译法制备a-^(32)P标记探针。通过斑点杂交试验检测10例临床样品及阳阴性对照病毒标准株。结果表明,该探针只与单纯疱疹病毒DNA杂交,而不与腺病毒Ⅲ型(Ad_3)、痘苗病毒(VV)、Vero细胞DNA杂交。且可检测出至少5pg的同源序列DNA。表明该探针具有良好的特异性和敏感性。检测的10例临床标本有两例出现阳性,与病毒分离培养结果一致。

162例子宫颈病变高危型HPV感染情况分析

目的调查162例子宫颈病变患者宫颈组织高危型HPV感染情况．探讨高危型HPV感染与宫颈病变的关系。方法采用第二代杂交捕获技术检测2003年11月～2005年9月在我院行LEEP治疗的162例住院患者宫颈高危型HPV感染情况．并与病理诊断和分级进行回顾性分析。结果162例宫颈病变患者．其中慢性宫颈炎32例。CINⅠ42例，CINⅡ54例。CINⅢ34例。其高危型HPV感染率则分别为18．8％、61．9％、83．3％和85．3％。高度CIN的高危型HPV感染率明显高于低度CIN和慢性宫颈炎（P〈0．05和0．001）。结论高危型HPV感染与宫颈病变的发生、发展有关，并随病变程度的加重，感染率增高。

用原位杂交技术检测人子宫颈癌组织中HPV16E_6转化基因的研究

应用地高辛非放射性标记与检测系统制备人乳头瘤病毒１６型Ｅ６（ＨＰＶ１６Ｅ６）转化基因ＤＮＡ探针，经用斑点杂交检测，探针特异性强，灵敏度达０．１ｐｇ，应用组织切片原位杂交技术检测了４４例子宫颈癌组织。结果表明，ＨＰＶ１６Ｅ６阳性２７例、占６１．３６％，５例正常对照子宫颈组织中未检出。提示ＨＰＶ１６Ｅ６转化基因与子宫颈癌密切相关，为阐明子宫颈癌的病因和ＨＰＶ１６Ｅ６在诊治子宫颈癌中的作用提供了理论依据。

原位杂交检测肝组织中的TTV

选取非甲～非庚型肝炎后肝病死亡患者肝组织 ,制备地高辛标记的特异性TTVDNA探针 ,应用原位杂交方法检测肝组织中TTV ,观察TTV对肝组织感染的形态学特点 ,为TTV的致病性研究提供依据。通过本研究建立了可靠而稳定的TTV原位杂交检测方法 ,8例肝组织标本中 4例原位杂交阳性 ,TTV阳性杂交信号呈核型 ,阳性细胞在肝组织中散在分布 ,部分肝小叶可有较密集的阳性细胞 ,提示TTV可能是一种致肝病的病毒。

分子杂交技术对外周血单个核细胞及肝细胞内HBV-DNA的初步研究

本文分别用转移印迹杂交和斑点杂交检测61例乙肝患者外周血单个核细胞(PBMC)及血清中的HBV-DNA。同时用转移印迹杂交和原位杂交检测其中31例患者肝活检组织中的HBV-DNA。结果发现血清、PBMC及肝组织HBV-DNA阳性率分别为26.2％(16/61),24.6％(15/61)及48.4％(15/31)。同一个体内,血清、PBMC及肝组织内HBV-DNA之间无明确的关联,血清HBV-DNA阴性时,仍可在11例患者的PBMC或肝内检出HBV-DNA。结果表明,PBMC可能也是独立于肝外的HBV贮存及复制的场所。血清HBV-DNA阴性不能否定体内仍有HBV复制的可能。

散发性病毒性脑炎免疫组化和原位杂交研究

２０例临床诊断为散发性病毒性脑炎的尸检和活检脑组织，通过单纯疱疹病毒多克隆抗体免疫组化和生物素标记单纯疱疹病毒ＤＮＡ探针原位杂交研究，５例诊断为单纯疱疹病毒脑炎。结果说明：单纯疱疹病毒是国内散发性病毒性脑炎的重要病原；免疫组化和原位杂交是诊断单纯疱疹脑炎的两种敏感方法。

人原发性肝细胞癌地高辛素标记HBV DNA探针的原位杂交与C－myc和P_（53）癌基因表达相互关系的研究

取自肝癌高发区的４０例人原发性肝细胞癌（ＰＨＣ）标本，应用地高辛素（Ｄｉｇ）标记ＨＢＶＤＮＡ探针作原位杂交，检测ＰＨＣ和癌周肝组织内ＨＢＶＤＮＡ的表达，并用光敏生物素Ｃ－ｍｙｃ癌基因探针原位杂交和用免疫组化检测ＨＢｓＡｇ，ＨＢｃＡｇ及Ｐ５３癌基因在ＰＨＣ和癌周肝组织内的表达。Ｄｉｇ－ＨＢＶＤＮＡ探针肝内总阳性率为８０％，在ＰＨＣ内为６５％，而癌周肝组织中为７３％。ＨＢＶ－ＤＮＡ定位于肝细胞或癌细胞的胞浆和胞核内，而ＨＢＶＤＮＡ阳性颗粒在胞浆内比胞核内多。ＨＢＶＤＮＡ阳性细胞癌周比癌内更多。结果表明，ＰＨＣ病例与ＨＢＶ存在关系密切；癌内ＨＢＶＤＮＡ大都属整合型，而癌周属游离型。研讨ＰＨＣ内ＨＢＶＤＮＡ的表达与ＨＢｓＡｇ，ＨＢｃＡｇ，和Ｐ５３及Ｃ－ｍｙｃ癌基因的表达相互关系及致癌作用。

组织原位杂交法研究输血传播病毒的致病性

目的 根据肝组织中TT病毒 (TTV)感染和复制状况探讨病毒的致病性。方法 以重组质粒为模板、地高辛素为标记物、对称和不对称PCR法分别标记TTV双链探针和 2条单链探针。原位杂交检测 5 6例肝组织 ,其中 6例TTV阳性者分别做单链探针杂交。结果 5 1例非甲～非庚型肝炎肝组织中TTV阳性率 2 7 5 % (14/5 1)。对照组 5例杂交阴性。TTVDNA主要见于肝细胞核内 ,受染细胞的病变和坏死不十分明显 ;在急性、慢性和重症肝炎及肝硬化组织中均有检出。用单链探针检测病毒基因链的结果与双链探针杂交结果一致 ,杂交信号强度相仿 ;2例肝组织TTV基因链与互补链同时存在 ,信号强度较弱。结论 TTV可能导致肝损伤 ,并在肝脏内有复制 ;

小儿感染庚型肝炎病毒后肝脏病毒核酸分布与临床关系的研究

目的 探讨小儿庚型肝炎病毒感染、肝脏庚型肝炎病毒核糖核酸 (HGVRNA)分布与其他HGV标志、肝脏病理损害及与临床的关系。方法 应用原位杂交 (ISH)检测 17例小儿乙型肝炎患儿肝脏HGVRNA。结果 17例血清抗 HGV阳性者 ,其中肝脏HGVRNA阳性 9例 (9/ 17,5 3% )。肝脏HGVRNA分布在汇管区周围 ,在肝小叶呈散在分布 ,多呈胞浆型 ;肝脏HGVRNA阳性组病变和阴性组比较以轻度 (G2 级以下 )为多 ,与肝纤维化无关 ;与肝脏HGAg无相关性 ,与抗 HGV相关(P =0 .0 13) ;与血清丙氨酸转氨酶 (ALT)、血清胆红素 (SB)和蛋白电泳的γ球蛋白升高无相关性。结论HGV即使有一定的致病性 ,其致病力也很弱。对HGV的致病性还需做进一步深入研究。

肝炎病毒诊断分型寡核苷酸芯片的制备与应用

目的研制联合诊断HBV、HDV、HCV及HCV分型的寡核苷酸（Oligo）芯片，并进行系列优化及临床应用性研究。方法从GenBank数据库获取HBV全长DNA序列，HDV及HCV4个基因型全长cDNA序列，根据BLAST分析结果获得HBV、HDV种属保守序列及HCV各型特异性序列，以作为设计Oligo探针的备选序列。用Array designer 3．0分别对BLAST检索所得的HBV、HDV种属保守序列和HCV型特异性序列逐一进行分析，设计长度均一的60mer Oligo探针。从HBV、HDV、HCV种属保守序列和HCV型特异性序列中分别挑选出16、8、68条60 mer Oligo探针。Oligo探针合成和纯化后，用芯片打印仪固定在玻片上。为便于研究，先后制备了2种芯片，包括HBV、HDV诊断芯片、HCV分型芯片。采用限制性显示PCR技术进行样品荧光标记后与芯片杂交，并根据杂交结果筛除了有非特异杂交和信噪比低于4．0的探针，选取高特异的探针制备了HBV、HDV、HCV联合诊断分型芯片。结果从杂交效果来看，研制的Oligo芯片特异性较高，可有效用于HBV、HDV、HCV的联合诊断及HCV的分型。为了适应临床诊断的要求，对芯片进行了实验条件摸索和一些优化，均取得较好的效果。结论制备的肝炎病毒诊断分型芯片检测敏感性、特异性均佳，具有较为广阔的应用前景，为下一阶段进行中试规模的临床血清样品检测做好了准备。

不同探针结构对应用微阵列技术检测兰花病毒结果的影响

根据黄瓜花叶病毒(CMV)、齿舌兰环斑病毒(ORSV)、建兰花叶病毒(Cym MV)、辣椒褪绿病毒(Ca CV)和落葵皱纹花叶病毒(Ba RMV)等5种危害较大的兰花病毒多重RT-PCR扩增产物序列,分别设计了5′端不同poly(d T)长短的探针,分别是:带poly(d T)15 spacer结构、带poly(d T)5 spacer结构、不带poly(d T)spacer结构,比较了3种探针紫外交联后的杂交效果。结果表明:5′端带poly(d T)15结构的探针杂交效率最高,而5′端不带poly(d T)结构的探针杂交效果极差,提示在探针设计时应选择在5′端带poly(d T)15结构以便获得更好的杂交效果。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B肝细胞结合蛋白基因的筛选与克隆

目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)相互作用蛋白的基因,明确其具体作用机制。方法应用酵母双杂交系统3,将多聚酶链反应(PCR)法扩增的HCVNS4B基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和Xα半乳糖(Xαgal)上进行双重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠埃希菌,接种在氨苄西林LB平板上,选择生长菌落,提取质粒酶切鉴定,测序并在GenBank中进行生物信息学分析。结果成功克隆出HCVNS4B基因并在酵母细胞中表达,与肝文库配合后选出既能在4缺(SD/TrpLeuAdeHis)培养基又能在铺有Xαgal的4缺培养基上生长,并变成蓝色的真阳性菌落5个,序列分析显示,筛选到的肝细胞蛋白编码基因参与细胞代谢、生物氧化、生长调节等多种生物学过程。结论成功克隆出HCVNS4B蛋白与肝细胞相互作用蛋白,为进一步研究NS4B蛋白的功能,阐明HCV致病的分子生物学机制提供了新线索。

丙型肝炎病毒核心蛋白与转位蛋白相互作用的研究

目的 本文为了探讨丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白 (core)在肝肿瘤中起作用的分子机制 ,研究核心蛋白是否与肿瘤相关蛋白的相互作用。方法 应用酵母双杂交系统 3构建HCV核心蛋白诱饵质粒 ,转化酵母AH10 9后与含文库质粒的酵母Y187进行配合 ,在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选。筛选出 30个克隆 ,对既能在四缺营养缺陷培养基上生长 (SD/ Trp Leu His Ade) ,又能在涂有x α gal的四缺培养平皿上长出蓝色菌落 ,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌后测序 ,进行生物信息学分析。发现一个可以引起染色体转位的基因即与肿瘤发生有关的基因转位蛋白基因 (Translin)同源。为了进一步证实转位蛋白基因所表达蛋白能与HCV核心蛋白相互作用 ,网织红细胞裂解物进行体外翻译、蛋白之间的免疫共沉淀。结果 结果显示 ,转位蛋白不但在酵母双杂交中能与HCV核心蛋白相互作用 ,而且在体外翻译后也能相互作用。结论 HCV核心蛋白可以和转位蛋白相互作用 ,推测此蛋白可能在HCV致癌中起一定作用 ,部分解释了HCV引起肿瘤的发病机制。