高亲和力大豆凝集素单抗制备及免疫学特性鉴定

为制备高亲和力的大豆凝集素(SBA)单克隆抗体,本试验以50μg SBA蛋白/200μL乳化液/只的剂量免疫BALB/c小鼠,间接ELISA和间接竞争ELISA鉴定多抗血清效价和灵敏性。选择血清效价和灵敏性较好的小鼠进行细胞融合。通过有限稀释亚克隆筛选出能稳定分泌SBA单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株。采用体内诱生腹水法批量制备SBA单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。结果表明,SBA免疫的4只小鼠中,1号小鼠效价最高且灵敏性最好,半数抑制浓度(IC50)为571.4μg·L^-1。选取该小鼠进行细胞融合,并最终得到1株杂交瘤细胞,命名为5B4E10。制备的SBA单克隆抗体的效价达到1∶409600以上,IC50为82.04μg·L^-1,亚型为IgG1型,亲和力常数(Ka)为1.83×10^9 L·mol^-1。且该抗体与大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和其他抗营养因子无交叉反应。本研究结果为建立大豆及其制品中SBA的免疫学检测方法奠定了良好的抗体基础。

专一识别甲酯化赤霉素7,4的单克隆抗体的制备

合成GA_3-3-O-HSA免疫原的同时,往往产生GA_3-7-CONH-HSA等其它成分,从而有可能通过特定的ELISA分步筛选法,在一次单抗研制流程中兼得两类针对不同GA_3抗原决定簇的单克隆抗体(MAbs)。交叉反应结果表明,其中的MAb BG2对GA_(7/4)甲酯具有高亲和力和专一性,它与GA_7me的亲和力比GA_3me与GA_1me分别高出100与200倍。7位羧基的申酯化可显著增加GA与该抗体的结合,而A环上双键或3β羟基的缺失,19,10-r-内酯环的破坏及D环上13位羟基的存在却严重降低GA与它的结合。这种高专一性的单抗将可用于高等植物和真菌体内早期非羟化途径中的GA_7与GA_4的免疫定量与定位研究。用该抗体建立的GA_4me与GA_7meELISAs具有极高的灵敏度,两者的检测范围分别为1.0×10^(-14)～1.0×10^(12)mol与2.0×10^(-15)～2.0×10^(-13)mol。

应用酶联免疫吸附试验检测抗可溶性抗原单克隆抗体方法的探讨

本文以提纯冻存抗原和回收抗原包被40孔聚苯乙烯固相载体,采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测抗可溶性抗原杂交瘤上清液。比较了不同的封闭剂及其浓度对实验结果的影响。实验结果表明,应用回收抗原和提纯的抗原检测结果一致,可代替首次抗原进行检测,并节约试剂的用量。同时证明20％小牛血清-吐温磷酸缓冲液(FCS-PBS-T)作为封闭剂检测,效果较好,明显优于用1％BSA-PBS-T作为封闭剂。

改进双抗夹心ELISA用于筛选单抗杂交瘤细胞株

本文利用改进双抗夹心ELISA筛选一种可测定血清样品中与血浆蛋白结合的蛋白质药物的单抗。用兔抗K102多抗经亲和层析纯化并包被后,加入用10%猴血浆PBS还原后的抗原K102,再加入杂交瘤细胞株上清液和HRP-羊抗鼠IgG、底物反应液筛选阳性单抗杂交瘤细胞株。结果用改进后的双抗夹心ELISA筛成功地选出6株能稳定分泌针对K102的单抗杂交瘤细胞株,分别命名为1C9、2D7、3E2、5F4、5F6、6B9;细胞株产生的单抗用ELISA法能检测出血清样品中的K102的浓度。提示改进的双抗夹心ELISA可用于针对与血浆蛋白结合的蛋白质药物的单抗杂交瘤细胞株的筛选。

基于HTS-ELISA的单克隆抗体分泌杂交瘤细胞筛选技术进展

基于单克隆抗体的各类免疫分析技术是现代食品安全快速检测技术发展的主要方向之一,因此,高活性单克隆抗体的制备方法自然为众多研究者所关注。通常单克隆抗体的制备过程涉及到很多技术环节,包括抗原制备、免疫剂量设计、细胞融合、活性杂交瘤细胞筛选以及抗体纯化等,其中分泌单克隆抗体杂交瘤细胞的筛选环节是单克隆抗体制备的关键一环。为此,本文主要介绍了一种基于HTS-ELISA的高活性单克隆抗体分泌杂交瘤细胞的筛选技术,重点是对融合细胞的低密度培养、特殊仪器设备和在筛选过程中如何依据拖孔数(Trailing)来判断杂交瘤细胞的活性等相关的原理和技术,旨在为我国高活性单克隆抗体制备技术的发展及加快食品安全快速检测技术的发展提供一个参考方法。

细胞表面荧光免疫吸附法在猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体杂交瘤筛选中的应用

为验证细胞表面荧光免疫吸附法(CSFIA)筛选高活性杂交瘤细胞的效果,本研究以原核表达的猪流行性腹泻病毒(PEDV)重组N蛋白为免疫原,免疫6周龄~8周龄的BALB/c雌性小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,分别采用CSFIA和间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,并检测目的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体(MAb)效价。结果显示,CSFIA筛选的MAb 1B1比间接ELISA筛选的MAb 3D3抗体效价高10倍,并且通过观察荧光强度能够实现杂交瘤细胞的一次性筛选,无需多次亚克隆,周期缩短约30 d。本研究表明CSFIA在筛选杂交瘤细胞中具有简单、直观和高效的优点,是一种值得推广的快速制备MAb的新方法。

一种改进的分泌抗半抗原抗体杂交瘤细胞株筛选方法

目的:研究解决半抗原分子单克隆抗体制备技术路径中遇到的在阳性杂交瘤细胞株筛选时无法排除载体蛋白间交叉反应影响的问题,以半抗原去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)为例。方法:在NE完全抗原免疫小鼠实施细胞融合后,分别包被牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)、BSA-NE、OVA-NE等4种不同抗原的酶标板平行检测细胞培养上清液;挑选BSA、OVA检测结果为阴性,BSA-NE、OVA-NE检测结果为阳性的孔内细胞进行克隆化筛选单克隆细胞。结果:本筛选方法可一次性从8板96孔板中筛选到13个符合要求的阳性孔,经3次克隆化后获得6株特异性强的杂交瘤细胞株。结论:本方法避免了载体蛋白间交叉反应对筛选的影响,改进了传统的单一指标筛选方法,筛选效率更高。

一种新的单克隆抗体检测方法在杂交瘤阳性细胞克隆筛选中的应用

目的探讨将一种新的检测抗人血清IgG及白蛋白单克隆抗体的方法应用在杂交瘤阳性细胞克隆筛选中。方法分别将人血清IgG和白蛋白连接到微球Beads上,混合2种微球,然后与抗人血清IgG及白蛋白的单克隆抗体发生特异性反应,再与连接有荧光R-藻红蛋白(R-phycoerythrin,R-PE)的羊抗小鼠IgG抗体发生反应,最后在Luminex200仪器上读取微球上的平均荧光强度(MFI)值。结果抗人血清IgG及白蛋白单克隆抗体只与其相对应的微球发生特异性反应,2种抗体同时测定时,不互相干扰。当用该方法测定含有抗人血清IgG或白蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞培养上清液时,微球MFI值明显高于不含该抗体的上清液中微球的MFI值。结论该检测法具有较好的特异性,敏感性和重复性,可以应用到抗人血清IgG和白蛋白单克隆抗体杂交瘤阳性细胞克隆的筛选中。

抗萘单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建

为了构建针对石油运输泄露导致的海洋环境中萘等多环芳烃污染的免疫学快速检测方法,需获得高效稳定的分泌抗萘单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本文以2-萘丁酸-KLH为免疫抗原免疫BALb/c小鼠,间接竞争ELISA测定小鼠血清效价,用细胞融合筛选技术筛选抗萘单克隆抗体杂交瘤细胞株,捕获ELISA测定小鼠免疫球蛋白亚型。结果显示,实验小鼠免疫血清效价最高能达到1∶80000,经过HAT筛选、复检和亚克隆后得到5个能分泌抗萘单克隆抗体的细胞株,细胞株上清液效价最高能达到1∶15625,抗萘单克隆抗体免疫球蛋白亚型均为IgG1,Kappa轻链。本方法成功构建的杂交瘤细胞株能稳定高效分泌抗萘单克隆抗体,抗体亚型符合免疫学检测的特性,为萘的ELISA检测方法建立及胶体金免疫层析(GICA)试纸条的研制提供了稳定高效的单克隆抗体源。

抗DEP单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建

为构建针对水环境中邻苯二甲酸二乙酯(Diethyl phthalate,DEP)等邻苯二甲酸酯类(Phthalates,PAEs)化合物的免疫学快速检测方法,需获得高效稳定的分泌抗DEP单克隆抗体的杂交瘤细胞株.以邻苯二甲酸单乙酯(Monoethylphthalate,MEP)-BSA为免疫抗原免疫BALb/c小鼠,间接竞争ELISA测定小鼠血清效价,用细胞融合筛选技术筛选抗DEP单克隆抗体杂交瘤细胞株.结果显示,实验小鼠免疫血清效价最高能达到1:5 000,经过HAT筛选、复检和亚克隆后得到9个能分泌抗DEP单克隆抗体的细胞株,细胞株上清液效价最高能达到1:10 000,对DEP的抑制率最高能达到86.5%,且其对11种结构类似物的交叉反应率均低于0.1%,特异性较好.本研究成功构建的杂交瘤细胞株能稳定高效分泌抗DEP单克隆抗体,可为DEP的ELISA检测方法建立及胶体金免疫层析(Colloidal gold immunochromatography assay,GICA)试纸条的研制提供稳定高效的单克隆抗体源.