供体细胞来源和TSA处理对牦牛iSCNT胚胎重编程的影响

【目的】探讨不同来源的供体细胞和TSA处理对牦牛异种体细胞核移植(Interspecies nuclear trans-fer,iSCNT)胚胎的影响。【方法】以黄牛卵母细胞为受体,分别以牦牛50日龄胎儿及6和18月龄个体成纤维细胞为供体,构建牦牛iSCNT胚胎,研究供体细胞来源对牦牛iSCNT胚胎的影响。分别用0(对照),20,40,60和80nmol/L的TSA处理50日龄胎儿成纤维细胞12h,构建iSCNT胚胎,比较其发育情况,确定TSA的最佳处理浓度;用最佳浓度的TSA处理50日龄胎儿成纤维细胞0(对照),6,12和18h,构建iSCNT胚胎,比较其发育情况,确定TSA的最佳处理时间。用最佳TSA作用时间和浓度处理供体细胞,构建牦牛iSCNT,之后用40和80nmol/L的TSA分别处理iSCNT胚胎6和12h,比较不同处理方式对牦牛iSCNT胚胎发育的影响。采用qRT-PCR方法检测40nmol/L TSA处理供体细胞6h的iSCNT胚胎及40nmol/L TSA处理供体细胞6h且处理iSCNT胚胎12h的iSCNT胚胎去乙酰化酶2(HDAC2)基因mRNA的表达水平,以不进行TSA处理的iSCNT胚胎为对照。【结果】以50日龄胎儿成纤维细胞作为供体细胞,牦牛iSCNT胚胎的囊胚率最高,但与其他组差异不显著(P>0.05)。40nmol/L TSA处理供体细胞6h能显著提高牦牛iSCNT胚胎的囊胚率(30.6%),且与对照组差异显著(P<0.05)。用40nmol/L TSA处理牦牛iSCNT胚胎12h组的囊胚率高于80nmol/L TSA处理iSCNT胚胎6h组,2组间差异不显著(P>0.05)。用TSA处理供体细胞和iSCNT胚胎之后,HDAC2mRNA表达水平降低,且与对照组差异显著(P<0.05)。【结论】不同来源的供体细胞对iSCNT胚胎发育的影响不明显;40nmol/L TSA处理供体细胞6h和iSCNT胚胎12h能显著提高牦牛iSCNT胚胎体外发育及重编程能力。

Blastocyst Formation and Chromosome Statuses of Reconstructed Embryos Derived from Interspecies Somatic Cell Nuclear Transfer (iSCNT)

Objective To analyze the blastocyst formation and chromosome statuses of reconstructed embryos derived from human-goat interspecies somatic cell nuclear transfer （iSCNT）, exploring the development retardant factors. Methods Human specific point probes cep2, cep6, tel2 and 13q14.2, 21q22.13 combining fluorescence in-situ hybridization （FISH） technology were used to test trophectoderm cells of blastocyst and blastomeres of development arrest nuclear transfer （NT） embryos. Results A total of 209 reconstructed embryos were recovered, and the rate of blastocyst formation was 3.8% （8/209）. FISH signals showed that chromosomal abnormalities were present in 2 blastocysts （2/8） and 146 development arrest embryos （146/201）. Conclusion The rate of blastocyst formation is low, and reconstituted embryos of development arrest showed extensive chromosome abnormalities, suggesting that a chromosomal mechanism may underlie their developmental arrest.

TSA和VPA处理对食蟹猴-猪异种体细胞核移植胚胎早期发育的影响

食蟹猴-猪异种体细胞核移植(Interspecies somatic cell nuclear transfer,iSCNT)研究旨在由iSCNT胚胎建立具有与人类相似遗传背景的胚胎干细胞(ESCs),作为医学和基础科学研究的实验材料。文章探讨了两种组蛋白脱乙酰化酶抑制剂(HDACi)Trichostatin A(TSA)和Valproic acid(VPA)处理浓度、时间与培养液(PZM-3和HECM-10)组合对食蟹猴-猪iSCNT胚胎早期发育的影响。结果表明,在PZM-3中添加10 nmol/L TSA处理48 h组的囊胚率显著高于对照组(22.78%vs 9.86%,P<0.05)。但是,不管在PZM-3或是HECM-10中,添加2～10mmol/L VPA处理均不能提高iSCNT胚胎早期发育能力。文章证明了TSA处理可以提高食蟹猴-猪iSCNT胚胎早期发育能力。

食蟹猴—猪异种体细胞核移植胚胎的构建

【目的】探索食蟹猴—猪异种核移植胚胎的发育能力,为食蟹猴异种核移植胚胎干细胞的构建奠定基础。【方法】以食蟹猴和猪胎儿的耳部成纤维细胞为供体,猪MII期去核卵母细胞为受体,构建异种核移植重构胚,并从核移植融合/激活方式、培养液两个方面进行优化。【结果】70枚食蟹猴—猪异种核移植胚胎中,有49枚分裂(70.0%),与猪同种核移植胚胎的分裂率(76.6%)无显著差异;使用微卫星引物D15S823对食蟹猴—猪异种核移植胚胎进行遗传学鉴定,均能扩增获得D15S823条带(350 bp);食蟹猴—猪异种核移植胚胎融合后1 h的染色体早熟凝集率(24.2%)显著低于猪同种核移植胚胎(44.7%)和猪孤雌激活胚胎(100.0%),通过使用无Ca2+融合液能够显著提高染色体早熟凝集率(48.2%);在PZM-3、HECM-10和HECM-10+10%FBS 3种培养液中,食蟹猴—猪异种核移植胚胎的分裂率无显著差异。【结论】食蟹猴体细胞核能够在猪MII期去核卵母细胞胞质中发生核重塑,并发育到8-细胞阶段。

食蟹猴-猪异种体细胞核移植的初步研究

采用食蟹猴耳部成纤维细胞作为核供体利用电融合法构建猴-猪异种核移植胚胎,研究其核重编机制并寻找适宜的培养基,初步建立食蟹猴-猪异种核移植体系。结果显示:(1)重构胚胎激活后3 h,供体核的大小基本不发生变化,但在激活后6 h大部分形成膨大的类原核。(2)食蟹猴-猪异种核移植胚胎融合率为74.2%,有70.5%的重构胚胎发生卵裂,29%的卵裂胚胎发育到桑椹胚阶段。(3)在NCSU-23+10%FCS和TCM199+10%FCS培养基中,重构胚突破4-细胞阻滞发育到8-细胞以上的比例分别为23.5%和17.0%,在NCSU-23培养基中的为19.9%,但是只有在NCSU23+10%FCS和TCM199+10%FCS培养基中重构胚胎发育到囊胚阶段(1.4%vs1.1%),尽管差异不显著。本研究首次建立了食蟹猴-猪异种体细胞克隆体系。

人神经母细胞瘤细胞异种克隆胞质受体的选择

本研究检测人神经母细胞瘤细胞-水牛和人神经母细胞瘤细胞-猪重构胚胎的体外发育潜能,以期建立人神经细胞母细胞瘤细胞的异种治疗性克隆模型,为进一步研究人癌症发生过程中的表观遗传学修饰机制及分离得到正常的人类胚胎干细胞奠定基础。分别以水牛颗粒细胞和人神经母细胞瘤细胞为供体,水牛卵母细胞为受体构建克隆胚胎,然后检测这2种重构胚胎的体外发育效率;再以猪卵母细胞为胞质受体,同样以上述2种体细胞为供体细胞构建重构胚胎。结果显示,人神经母细胞瘤细胞-水牛重构胚胎囊胚发育率显著低于水牛同种克隆胚胎的(1.1%∶12.1%,P<0.05),而融合率(83.7%∶79.4%,P>0.05)和卵裂率(55.8%∶58.2%,P>0.05)无显著差异。但是,当以猪卵母细胞为受体胞质时,人-猪重构胚胎卵裂率显著低于水牛-猪重构胚胎(43.7%∶89.8%,P<0.05),但重构胚胎融合率和囊胚率差异不显著(85.8%∶82.5%,0∶1.4%,P>0.05)。结果表明,人神经母细胞瘤细胞-水牛和人神经母细胞瘤细胞-猪异种重构胚胎可以在体外发育,尽管其囊胚发育率相对比较低。