基于多克隆抗体的糠氨酸ic-ELISA检测方法的建立

采用甲醛法制备了糠氨酸完全抗原,通过交叉验证确保了多克隆抗体的特异性,从而建立了基于该抗体的糠氨酸间接竞争酶联免疫吸附测定(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA)检测方法。结果显示,建立的ic-ELISA检测方法有效检测范围为12.20~2143.42 ng/mL,最低检测限为2.69 ng/mL。该方法操作简便、迅速,成本低廉,同时具备高灵敏度和优异特异性,为高效检测食品中糠氨酸质量浓度提供了新的选择,具有一定实际应用价值。

猪肉中2-(三氟甲基)吩噻嗪的Ic-ELISA检测

为了快速检测猪肉中的镇静剂2-(三氟甲基)吩噻嗪(2-(trifluoromethyl)phenothiazine,TFPTZ),分别用偶氮苯甲酸法、混合酸酐法合成了半抗原、完全抗原,通过免疫新西兰大耳白兔获得了多克隆抗体,采用间接竞争酶联免疫方法(Ic-ELISA)对猪肉中TFPTZ进行了定量分析,实验条件:包被抗原浓度1.25μg/mL,多克隆抗体稀释16000倍,37℃包被3 h,封闭液为质量分数1%的牛血清白蛋白(BSA),TFPTZ稀释液为含体积分数10%的DMSO的PBS,竞争反应60 min.该方法相关系数R^(2)为0.9991,IC_(50)为1.5002μg/L,最低检测限IC_(10)为0.2841μg/L,线性(IC_(20)~IC_(80))为0.4307~5.2252μg/L,与5种TFPTZ结构类似物的交叉反应率小于1.2%,样品添加回收率为93.26%~109.13%,变异系数小于6%,实际样品检测结果与高效液相色谱法测定结果高度一致,表明建立的快速检测猪肉中TFPTZ的Ic-ELISA方法具有良好的准确度,适用于快速检测猪肉中TFPTZ的残留量.

环丙沙星间接竞争ELISA(ic-ELISA)检测方法的建立

目的：建立环丙沙星残留的间接竞争ELISA检测方法。方法：用卵清白蛋白与环丙沙星偶联物做包被抗原,标准环丙沙星做竞争抗原,建立间接竞争ELISA方法,并用数学方法对结果进行了分析。结果：所建立的ELISA检测方法,最低检测限为2.77 ng/ml,检测范围为2.77～500 ng/ml。曲线回归方程为Y=-36.458X＋110.98,相关系数r2=0.9946。结论：该ELISA方法可以用于环丙沙星残留的快速检测。

DAS-ELISA、RT-PCR和IC-RT-PCR检测葡萄卷叶病毒Ⅲ的比较研究

在生长季节分3次对部分葡萄品种枝条上部、中部和下部叶片及韧皮部,进行双抗体夹心法(DAS-ELISA)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫捕捉反转录聚合酶链式反应(IC-RT-PCR)3种方法检测卷叶病毒Ⅲ(GLRaV-3)的比较。结果表明:DAS-ELISA的检出率明显低于RT-PCR和IC-RT-PCR方法。RT-PCR可以检测出RNA提取液为1:10-4的GLRaV-3病毒,但它受到了提取RNA难以及其它物质(如蛋白质、DNA等)干扰的影响,检测难度增加。从检测的灵敏度来看,RT-PCR和IC-RT-PCR比DAS-ELISA灵敏;并且,IC-RT-PCR比其它两种方法较快,整个过程仅需8h。

抗噻菌灵单克隆抗体的制备及异源IC-ELISA检测方法的建立

为建立噻菌灵酶免疫检测方法,制备3种噻菌灵的半抗原(H1、H2和H3)。利用活泼酯法制备免疫抗原H1-BSA、H3-BSA和包被抗原H1-OVA、H2-OVA、H3-OVA。采用杂交瘤细胞融合方法获得4株稳定分泌抗噻菌灵单克隆抗体的细胞株,分别命名为1-4G9、1-6D3、3-1F9和3-5D4。采用间接竞争酶联免疫法(IC-ELISA),将上述4株抗体分别与3种包被抗原进行组合,从中选择出一个最优组合:H3-OVA/1-6D3。据此建立的异源IC-ELISA检测方法对噻菌灵的IC50为10.9μg.L-1,检测限(IC10)为2.2μg.L-1,与3种噻菌灵类似物的交叉反应率均小于0.1%;在自来水、苹果、梨的添加回收试验中,IC-ELISA法测定的回收率依次为95.9%～118.1%、90.0%～117.6%、74.9%～95.6%;HPLC法测定的回收率依次为92.7%～97.6%、98.9%～100.9%、91.6%～105.4%,IC-ELISA法与HPLC法测定结果基本一致。上述结果表明:抗噻菌灵单克隆抗体酶免疫检测具有很强的特异性和准确性。

糖皮质激素广谱特异性单克隆抗体的制备及其ic-ELISA方法的建立

将氢化可的松半抗原HYD通过活化脂法与钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶联获得氢化可的松完整抗原KLH-HYD,并对小鼠肌肉注射此抗原,使小鼠免疫;通过杂交瘤技术获得1株能够稳定分泌氢化可的松的单克隆抗体细胞株HYD-C1,并通过腹水制备大量抗体。将氢化可的松半抗原HYD和地塞米松半抗原DEX通过活化脂法分别与卵清蛋白(ovalbumin,OVA)偶联作为包被原,建立糖皮质激素的间接竞争酶联免疫吸附检测(indirect competitive-enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA)方法。结果:在同源包被情况下氢化可的松灵敏度为1.63 ng/mL,异源包被情况下灵敏度为0.24 ng/mL;在交叉抑制实验中,异源策略中的各糖皮质激素灵敏度均高于同源策略中的结果,异源策略条件下很好地覆盖了本研究中所检测的糖皮质激素,使该抗体具备良好的广谱特异性。在异源策略添加回收实验中平均添加回收率在77.5%~111.3%之间,落在合理范围内,满足检测需求。结论:成功制备出氢化可的松单克隆抗体,建立了同源和异源策略糖皮质激素检测方法,结果发现异源策略中糖皮质激素的灵敏度高于同源策略,并使该方法具有更好的广谱特异性。

鸡传染性喉气管炎病毒gG蛋白间接竞争ELISA方法的建立及初步应用

鸡传染性喉气管炎是由鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起鸡的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。为建立检测该病毒g G蛋白的间接竞争ELISA方法,本研究以原核系统表达ILTV g G蛋白,并采用切胶纯化该重组g G蛋白(rg G)后经western blot检测纯化的rg G (P-rg G)与本研究室制备的g G蛋白单克隆抗体(MAb) 3C8的反应原性。将MAb 3C8采用Protein G亲和层析柱纯化后与HRP偶联(HRP-3C8),利用间接ELISA法测定纯化HRP-3C8的效价。结果显示,P-rg G与MAb 3C8发生了特异性反应,在30 ku处出现特异性条带。纯化的HRP-3C8效价达1∶51 200。以P-rg G作为包被抗原,以纯化的HRP-3C8作为检测抗体,通过对各反应条件优化后初步建立了ILTV g G蛋白间接竞争ELISA (ic-ELISA)检测方法。条件优化结果显示,P-rg G包被量为12.5 ng/孔,HRP-3C8抗体稀释度为1∶10 000,将待检样品与HRP-3C8抗体在37℃孵育40 min后加入ELISA板再反应20 min,TMB底物反应10 min。将待检样品的抑制率(PI)≥31.08%判为阳性;采用该方法分别检测ILTV、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡痘病毒(FPV),通过计算PI,评估该方法的特异性;按照Reed-Muench法测定ILTV K317株的鸡胚半数感染量(EID_(50)),再将该病毒2倍倍比稀释(1∶10~1∶2 560)后,以该ic-ELISA方法检测,评估该方法的敏感性;利用同批次和不同批次P-rg G分别包被ELISA板,采用该ic-ELISA方法检测ILTV阳性及阴性样品,评估该方法的重复性。结果显示,该方法除了能检测ILTV外,其余相关病毒均为阴性结果;将ILTV稀释至1∶320时检测结果仍为阳性,相当于75 EID_(50)/0.1 m L;批内、批间重复性试验的变异系数均小于10%。利用该方法及荧光定量PCR (q PCR)分别检测50份临床ILTV、IBV和FPV感染鸡的口咽拭子和喉头组织、10份ILTV活疫苗,该方法检测结果显示,阳性检测率为73.3%(44/60),阴性率为26.7%(16/60)。q PCR的检测结果显示,阳性检测率为81.7%(49/60),阴性率为18.3%(11/60),二者的阴、阳性符合率分别为90.9%和87.8%,总符合率为88.3%。本研究建立的ILTV g G蛋白ic-ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以用于检测实验室和临床ILTV感染的不同样品,为ILTV及其疫苗的检测提供了新的技术手段。

莫米松糠酸酯高特异性抗体制备及酶联免疫分析方法

莫米松糠酸酯(mometasone furoate,MF)是一种常见的糖皮质激素。为快速、便捷地监控MF的滥用情况,制备了MF单克隆抗体并建立了其竞争酶联免疫检测方法。将氨氧乙酸分别连接至MF和莫米松二糠酸酯(mometasone difuroate,MDF),合成了免疫半抗原和包被半抗原。免疫半抗原以活泼脂法连接钥孔血蓝蛋白获得全抗原,通过免疫小鼠、细胞融合及筛选获得能够稳定分泌抗MF单克隆抗体的细胞株,制备并纯化了抗体。该抗体的主要识别区域为MF的五元环区域,因此不和常见的64种糖皮质激素发生交叉反应。建立了基于异源包被的MF间接竞争酶联免疫检测法,其半抑制浓度(IC_(50))为1.2 ng/mL,对肌肉和肝脏的最低检出限分别为0.52μg/kg和0.59μg/kg。灵敏度相比于同源包被提升了20倍。使用60%甲醇水溶液提取动物组织的添加回收率为70%~82%。该方法能有效应用于动物组织中MF的快速筛查。

精喹禾灵酶联免疫吸咐分析(ELISA)研究

【目的】制备精喹禾灵的特异性抗体并建立精喹禾灵的间接竞争ELISA测定方法。【方法】精喹禾灵在碱性条件下水解合成了半抗原精喹禾灵酸,并与载体蛋白BSA和OVA偶联,分别合成了免疫抗原和包被抗原,偶联比分别为29.23和7.87。将Hapten-BSA免疫兔子获得多克隆抗体。【结果】抗血清的效价为200000。经酶联免疫吸附反应分析(ELISA)测定,精喹禾灵的抑制中浓度(IC50)为0.03495μg·ml-1,最低检测浓度(IC10)为0.002μg·ml-1,检测范围为0.002～0.5μg·ml-1。其与结构相似的物质几乎没有交叉反应,表明该方法具有很强的特异性,且在水样中的添加回收率为89.02%～108.88%。【结论】成功获得精喹禾灵特异性抗体并建立了水样中精喹禾灵农药残留的ELISA测定方法。

百合无症病毒的RT-PCR和IC-RT-PCR检测

应用DAS-ELISA,RT-PCR和IC-RT-PCR技术检测百合无症病毒(LSV)。结果表明:RT-PCR和IC-RT-PCR分别可从2ng和200ng百合叶片组织中检测出LSV,分别是DAS-ELISA敏感度的1000倍和10倍。百合鳞茎的不同取样部位对PCR检测结果的影响较大,RT-PCR难以从鳞片和根部检测出病毒,但IC-RT-PCR可以检测出病毒。

间接竞争ELISA法检测呋喃唑酮代谢物

以人工抗原和特异性抗体为基础，建立了以2-硝基苯甲醛为衍生试剂检测呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮（AOZ）间接竞争ELISA方法。通过方阵滴定和间接竞争法确定ELISA方法的抗原抗体的最佳工作浓度；得到标准曲线的线性范围为0．25-10ng／mL，线性关系良好；根据标准曲线计算IC50为0．5881-1．1333ng／mL。此外，检测了与其他类似物的交叉反应率，显示了很好的特异性；并且通过对虾样品添加回收率的测定，证明了该方法的准确性。高温短时间衍生化处理可达到与37℃孵育过夜同样的衍生效果。

农畜产品中三聚氰胺间接竞争ELISA检测方法的建立

利用制备的抗三聚氰胺单克隆抗体建立了间接竞争ELISA方法,采用棋盘滴定法确定最佳三聚氰胺-OVA包被浓度为1.0μg/mL,单抗最佳稀释度为1∶1 000,最佳的封闭液为50g/L的脱脂乳,标准曲线的线性方程为y=-15.12x+107.3(R2=0.997)。批内变异系数(CV)为1.07%～5.53%,批间CV值为3.33%～11.92%,确定此方法精确度良好。利用建立的间接竞争ELISA方法,测定添加有三聚氰胺标准溶液的样品(宠物食品、小麦面筋、饲料、牛乳、鸡蛋),得到三聚氰胺在各样品中的回收率范围分别为宠物食品73.8%～84.32%,小麦面筋67.3%～88.27%,饲料70.3%～85.9%,牛乳83.47%～89.76%,鸡蛋76.2%～87.29%。确定可以利用此间接竞争ELISA方法检测样品中的三聚氰胺含量。

柠檬黄的ELISA检测方法的建立

利用免疫学基本原理,获取抗柠檬黄的单克隆抗体,以此建立了从食品中检测柠檬黄的间接竞争ELISA.试验表明:OVA-TE最适包被浓度为1μg/mL;酶标抗体最适工作浓度为1:3000;酶标抗体的作用温度和时间分别为37℃,1h;封闭液为1%明胶;底物显色时间为15min;对柠檬黄的最低检出量为26.34ng/mL;抗体的最适稀释倍数为1:12000倍;对该方法进行交叉性试验和重复性试验,结果表明此法是一种特异、灵敏、快速的检测方法,并适合大批量样品检测.

食品中黄曲霉毒素M_(1)的间接竞争酶联免疫法的建立

该文建立一种间接竞争酶联免疫法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA)快速测定食品中黄曲霉毒素M_(1)(aflatoxin M_(1),AFM_(1))的分析方法。AFM_(1)标准品用甲醇稀释,AFM_(1)标准品与AFM_(1)全抗原竞争结合AFM_(1)单克隆抗体,利用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB)单组分显色液显色后,酶标仪测定吸光度。在优化好的条件下,浓度范围为9.743~2.605×10^(3)pg/mL时具有良好的线性关系,相关系数(determination coefficient,R^(2))为0.9927,检出限IC_(10)为3.84 pg/mL,加标回收率为88.43%~105.75%。该方法适用性好、操作简单、灵敏度高,满足食品中AFM_(1)分析检测的需求。

动物过敏原牛血清白蛋白间接竞争ELISA检测方法的建立

[目的]制备鼠抗牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)单克隆抗体,在此基础上建立可用于定量检测动物过敏原BSA含量的间接竞争酶联免疫检测方法(IC-ELISA)。[方法]采用BSA纯品为抗原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合技术制备抗BSA单克隆抗体,并对其特异性进行鉴定;在此基础上,建立BSA间接竞争ELISA检测方法,并对其分析条件进行优化。[结果]采用自行制备的特异性抗BSA单克隆抗体,建立间接竞争ELISA检测方法,优化得到最佳反应条件:抗原最佳包被浓度为0.25μg·m L^(-1),单抗最佳工作浓度为1∶32 000,酶标二抗最佳工作浓度为1∶10 000,最低检测限为6.71ng·m L^(-1),线性检测范围为3.593 8~460 ng·m L^(-1)。线性回归直线方程为y=-47.448 9x+135.866 3,相关系数R2=0.997 3,P<0.000 1。[结论]该方法特异性强、灵敏度高、可靠性好,适用于食品中过敏原BSA的现场快速检测。

玉米赤霉烯酮间接竞争ELISA方法的建立

本研究以玉米面为例,建立了玉米赤霉烯酮间接竞争ELISA(ic-ELISA)方法。采用棋盘滴定法确定抗原和单抗的最佳工作浓度,并确定了抗原37℃包被1 h、不封闭、酶催化底物作用时间15 min的反应条件进行检测。该方法的检测范围(IC_(20)~IC_(80))为11~292 pg/mL,检测限(IC_(10))为6 pg/mL。玉米赤霉烯酮在玉米面中的加标回收率为81.29%~105.80%。本研究建立的ic-ELISA方法与赭曲霉素A、黄曲霉素B_(1)、呕吐毒素、伏马毒素B_(1)、T-2毒素无交叉反应,可用于玉米面中玉米赤霉烯酮的初筛检测。

达氟沙星多克隆抗体制备及间接竞争ELISA方法的建立

为制备达氟沙星(DAN)多克隆抗体,建立检测DAN残留的间接竞争ELISA(ic-ELISA)方法,采用混合酸酐法制备免疫原DAN-BSA和包被原DAN-OVA,用DAN-BSA免疫新西兰大白兔获得DAN多抗血清,建立检测DAN的ic-ELISA检测方法。结果显示,成功合成了DAN-BSA和DAN-OVA,并获得DAN的多克隆抗体;用该抗体建立的ic-ELISA检测方法的半数抑制浓度为0.39μg/L,最低检测限为0.04μg/L,检测范围为0.09μg/L~6.16μg/L。结果表明,成功制备了抗DAN的多克隆抗体,并建立了检测DAN的ic-ELISA方法,为进一步开发DAN快速检测试剂盒奠定了基础。

ELISA测定猪尿液中β-受体激动剂残留的准确性评价

本研究建立克伦特罗间接竞争ELISA检测方法,对检测条件进行了优化确定,并利用猪尿液进行添加回收试验。结果显示:ELISA反应CLE-OVA包被抗原和CLE单抗的最适浓度分别为1:40 000和1:20 000,间接竞争ELISA的线性范围为0.016 l^8.520 0 ng/mL。该方法对克伦特罗、溴氯特罗、马布特罗和溴布特罗均有交叉反应。对冷冻储存半年以上的猪尿进行ELISA测定时,发现检测限可达58.848 3 ng/mL,药物添加回收率为85.19%~5 173.25%,变异系数为4.78%~96.79%;而经过MCX固相萃取柱净化处理后,检测限为0.076 ng/mL,添加回收率在101.21%~119.10%之间,变异系数为6.05%~18.38%。结果表明,SPE净化处理后,可有效去除尿液中的色素、蛋白等基质,提高了该法的灵敏度和准确性。

鸡、鸭肉中金刚烷胺、金刚乙胺、索金刚胺间接竞争ELISA检测方法研究

目的:建立一种检测鸡肉、鸭肉中金刚烷胺、金刚乙胺、索金刚胺的间接竞争酶联免疫吸附方法(Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA)。方法:本研究基于间接竞争酶联免疫方法的原理,在酶标板微孔中预包被偶联抗原,样本中含有的金刚烷胺、金刚乙胺、索金刚胺与微孔中预包被的偶联抗原特异性地竞争酶标记抗体,催化底物显色,根据显色深浅来计算样本中金刚烷胺类药物的含量。结果:金刚烷胺、金刚乙胺、索金刚胺的检测限分别为:0.57、0.42、0.41μg/kg(鸡肉)和0.59、0.40、0.38μg/kg(鸭肉);定量限分别为0.85、0.63、0.69μg/kg(鸡肉)和0.94、0.68、0.52μg/kg(鸭肉);添加回收率范围为67.0%~117.9%;日内变异系数6.3%~12.7%,日间变异系数8.1%~14.5%,且实际样品检测结果与HPLC-MS一致性较高(R 2=0.9990),表明该方法具有良好的准确度和精密度。结论:本研究建立的ic-ELISA方法适用于鸡鸭肉样品中金刚烷胺类药物残留的检测,方法的灵敏度高、稳定性好,可应用于批量样本的快速筛查,具有良好的实际应用价值。