PREPARATION OF CHITOSAN COATED METAL AFFINITY CHROMATOGRAPHY ADSORBENT

A new and an inexpensive adsorbent of chitosan coated silica for immobilized metal affinity chromatography (IMIC) was studied. After a double coating, the chitosan coated on silica beads could be up to 53. 4 mg/g silica beads.When pH＞3. 8, the metal ligand Cu2+ was chelated on the coated chitosan witha bound capacity of 14. 6 mg/g chitosan without introducing iminodiacetic acid(IDA).

定量磷酸化蛋白质组解析17β-雌二醇致死效应的细胞调控过程

17β-雌二醇(E2)是人体内一种重要的内分泌激素,在生理浓度下(0.2~1.0 nmol/L)对生殖系统、乳腺等靶器官的生长发育起着重要的调节作用。但很多研究表明,高剂量(μmol/L~mmol/L)的E2能够诱导肿瘤组织消退和细胞凋亡,其具体调控机制尚不明确。本工作聚焦于高剂量(μmol/L)的E2致死效应,首先分析了μmol/L水平的E2对HeLa细胞表型的影响,发现在1~10μmol/L下E2以浓度依赖的形式抑制HeLa细胞增殖,并诱导HeLa细胞发生死亡,其中,用5μmol/L E2处理2天后可使约74%的HeLa细胞增殖受到抑制,并引起约50%的HeLa细胞死亡。在此基础上,为了探究高剂量E2诱导细胞死亡的内在调控过程,将基于固相萃取(SPE)的固定化钛离子亲和色谱技术(Ti 4+-IMAC)与基于数据非依赖采集模式(DIA)的蛋白质组定量技术结合,用于筛选HeLa细胞内参与高剂量(μmol/L)E2致死效应调控过程的磷酸化位点。最终,在5μmol/L E2和二甲基亚砜(DMSO)处理的HeLa细胞中共鉴定到超过10000个磷酸化位点;t检验分析发现,在E2处理后,有924个磷酸化位点(对应599个蛋白质)的丰度发生了显著变化(显著性水平(p)<0.01,|log 2(倍数变化)|≥1),推测其可能参与调控E2致死效应过程。此外,有453个磷酸化位点(对应325个蛋白质)仅单独发生在E2或DMSO处理后的HeLa细胞样品中,表明这些磷酸化位点在E2处理后发生了磷酸化或去磷酸化,也可能参与E2致死效应的调控过程。分别对以上两种方式筛选的E2调控的磷酸化蛋白质进行富集分析,发现这些磷酸化蛋白质主要参与细胞分裂、核糖体/核质转运、信使核糖核酸(mRNA)加工/剪接及转录等过程,表明高剂量的E2可能通过调控核糖体及mRNA加工等过程影响蛋白质转录,进而诱导细胞发生死亡。此外,我们发现表皮生长因子受体(EGFR)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族蛋白(包括MAPK1、MAPK4和MAPK14)上多个磷酸化位点的修饰水平在高剂量E2处理后发生了明显变化,表明EGFR和MAPK信号通路可能在雌激素诱导的细胞死亡中起着重要调控作用。本实验得到的磷酸化蛋白质组定量结果有助于进一步了解高剂量E2的内在调控过程,为后续解析高剂量E2的作用机制及疾病的治疗提供了参考。

改性与修饰壳聚糖固定化酶纯化抑肽酶研究

采用化学改性与修饰微珠壳聚糖为载体,共价法偶联牛胰蛋白酶,制成抑肽酶亲和吸附剂,单位活力5190KIU/g(湿),蛋白质偶联率605%,酶活性回收率55%;将其直接亲和层析牛肺提取液,分离纯化高比活抑肽酶.方法过程简单,样品比活力5700KIU/mg,质量稳定,成本较低;该吸附剂机械强度高,抗污染能力较强,非特异性吸附较小,可以反复使用,价格低廉,适合工业化生产.

金属螯合亲和色谱中固定金属与蛋白质的作用

在不同pHNaCl的磷酸缓冲体系 ,比较了牛血清蛋白 (BSA)、核糖核酸酶 (RNase)、细胞色素C(Cyt C)和溶菌酶 (Lys)在IDA裸柱和一些金属螯合柱上的保留特性 ,考察了固定金属对蛋白质保留行为的影响。指出蛋白质在强结合IDA Cu柱上的保留主要受固定金属和蛋白质间配位作用支配。在弱亲和的IDA Ni、IDA Co和IDA Zn柱上的保留主要受静电作用控制 ,配位作用为辅。讨论了金属螯合亲和色谱中影响蛋白质和金属配位的主要因素 :金属离子的电荷和半径、配位原子对中心离子外层d轨道的影响 ,以及蛋白质表面配位的组氨酸数目、离解常数和取向。影响金属螯合配体和蛋白质静电作用的主要因素为溶液的pH和蛋白质的等电点pI。

固定化金属螯合亲和膜色谱柱制备及纯化铜锌超氧化物歧化酶的研究

以大孔纤维素滤纸为基质 ,通过碱处理、环氧活化、偶联亚氨基二乙酸二钠、固定化Cu2 +,装柱后制得固定化金属螯合亲和膜色谱柱。对Cu/Zn SOD粗品进行了纯化研究 ,将其比活从 645U/mL提高到 6882U/mL ,纯化倍数为 1 0 7,蛋白回收率为 92 3% ,活性回收率达 985%。设计了一种解决金属离子泄露问题的方案 ,将Cu2 +泄露量降至 86μg/L。

亚氨基二乙酸-硅胶键合相的合成及其在核苷酸分析中的应用

以大孔微球硅胶（30nm，8μm）为基体，经γ－氨丙基三乙氧基硅烷活化与间隔臂氯代环氧丙烷反应后，再与螯合剂亚氨基二乙酸键合，后者与铜离子（Ⅱ）螯合后，构成定位金属离子亲和色谱固定相。用磷酸盐缓冲溶液（pH＝7．0）作流动相，经紫外吸收检测（260nm），对核苷酸混合物进行了高效液相色谱分析，取得较满意的结果。

固定化铜离子亲和膜色谱柱吸附血红蛋白的研究

将纤维素滤纸进行碱处理及环氧活化、偶联亚氨基二乙酸、固定化铜离子等处理,并将其装入自制的色谱柱管,制得固定化铜离子亲和膜色谱柱。该柱可用于吸附血红蛋白(hemoglobin,Hb),吸附率可达到90%以上。考察了上样量、pH值、温度、上样速度等因素对固定化铜离子亲和膜吸附Hb的影响。实验结果表明,固定化铜离子亲和膜色谱柱吸附血红蛋白的最佳条件为:室温下实验,缓冲体系的pH值控制在6～8,上样速度0.5～1.0mL/min,上样量为3.16～7.90mg/g。

基因工程人抗角蛋白抗体的免疫学纯化与鉴定

在成功克隆和表达了人源性抗角蛋白抗体之后，利用金属螯合亲和层析法进行提取纯化，并用Western blot、竞争抑制性ELISA和非竞争性酶免疫亲和力测定技术对该抗体的特异性、识别抗原组分以及亲和力等免疫学特性进行鉴定。结果发现，金属螯合亲和层析技术能够有效地将抗角蛋白可溶性Fab从表达上清中纯化出来。所制备抗体特异性良好，能够识别相对分子量45 000～48 000角蛋白，并具有较高的亲和力，亲和系数为3.5×109M－1。这种高特异性、高亲和力的人源性抗角蛋白抗体将在抗角蛋白自身抗体的功能与意义研究以及今后临床应用前景的探讨中发挥重要作用。

Candida rugosa脂肪酶同工酶的分离及选择固定化

采用“界面亲和层析” ,从商品Candidarugosa脂肪酶 (CRL)中分离到三个同工酶 (CRL 1、CRL 2和CRL 3) ,它们在水 有机溶剂双液相体系中催化 (R ,S) 萘普生甲酯的不对称水解反应 ,具有不同的立体选择性 .分析表明 :CRL 1和CRL 2上不同程度地非共价结合有小分子的酸性化合物 ,阻碍了其活性位点处疏水腔的完全开放 ;CRL 3上不含有该小分子酸性化合物 ,活性位点处疏水腔可处于完全开放构象 .据此分别将CRL同工酶选择性地固定在不同的载体 (GDX10 1和YWG NH2 )上 .通过简单易行的选择吸附步骤 ,可同时达到同工酶的分离及固定化目的 。

无水体系中环氧氯丙烷活化琼脂糖凝胶制备高载量固定化金属亲和层析介质

在以二甲基亚砜为溶剂的无水体系中,利用环氧氯丙烷对琼脂糖凝胶Sepharose6FastFlow进行活化,并偶联亚氨基二乙酸和Cu2+制备了固定化金属亲和层析介质.结果表明,该体系中环氧氯丙烷对琼脂糖凝胶的活化效率大幅度提高,在40%(φ)环氧氯丙烷、0.02g/mLNaOH及50℃、反应时间4h的优化条件下,环氧基活化密度最高达165μmol/mL,较目前报道的最高值提高50%以上.最终所制介质的Cu2+螯合密度为128.3μmol/mL,对BSA的平衡吸附容量达2.05mmol/L.以0.5mol/L咪唑为洗脱剂,被吸附的BSA洗脱率可达90%以上.

一种金属螯合连续棒色谱柱的制备及色谱性能

A procedure for the preparation of continuous rod consisting of poly(glycidyl methacrylate\|co\|ethylene dimethacrylate) for immobilized metal affinity chromatography (IMAC) is presented. When chelating Cu(Ⅱ), Zn(Ⅱ) or Ni(Ⅱ) on it, the rod displayed a property of IMAC and the selectivity for protein separation was different from that obtained from the naked rod. An abnormal increase in retention times of proteins was found under the condition of either very high pH or very low pH on the metal chelated rods.

金属螯合亲和层析法对人源宋内痢疾杆菌脂多糖抗独特型抗体重链可变区蛋白的纯化

在重组人宋内痢疾杆菌脂多糖抗独特型抗体重链可变区蛋白的表达质粒（ｐＱＥＨｖ）的氨基端插入６个组氨酸，使其对金属螯合层析介质能产生特异性吸附，可用金属螯合亲和层析法进行分离纯化。本研究采用ＮｉＮＴＡ螯合层析介质，以咪唑洗脱表达的蛋白。经ＥＬＩＳＡ检测，纯化的蛋白可特异地与抗宋内痢疾杆菌脂多糖的鼠ｍＡｂ５Ｂ１２发生反应。

重组Hepcidin融合蛋白的金属螯合亲和层析纯化

在大肠杆菌中表达的重组Hepcidin融合蛋白以包涵体形式存在,其N端带有6个组氨酸。以Ni2+-IDA-Sepharose Fast Flow为层析介质,在变性条件下以不同的咪唑和pH值洗脱方式对Hepcidin融合蛋白的纯化效果进行了比较,确定了该融合蛋白的金属螯合层析纯化条件。以60 mmol/L咪唑洗脱杂蛋白,然后将pH值降至4.0洗脱融合蛋白,纯化后的融合蛋白纯度大于95%,而且不含咪唑,有利于下一步Hepcidin的制备。金属螯合层析中融合蛋白收率不低于90%。Ni2+-IDA-Sepharose Fast Flow对该融合蛋白的吸附量为30.4 mg/mL。

磷蛋白组的研究技术及其进展

真核细胞中蛋白质磷酸化是一个重要事件。真核细胞利用可逆的蛋白磷酸化来控制许多细胞过程包括信号转换、基因表达、细胞周期等。磷蛋白组的研究涉及磷蛋白的分离和鉴定 ,磷酸化残基定位和定量分析。由于蛋白质磷酸化是一个动态过程 ,在细胞中磷蛋白含量低 ,磷酸化位点可变 ,且磷酸肽的质谱信号常常会受到抑制 ,所以磷蛋白的分析存在更多的困难。本文介绍了国内外在磷酸蛋白的分离鉴定及定量分析方面的研究技术以及进展情况。目前 ,质谱仍然是核心的鉴定技术 ,寻找更好富集方法是最大的挑战。定量蛋白组学是对蛋白质的差异表达进行精确的定量分析。目前还不存在一种独立的方法可以完成磷蛋白的分离、鉴定 ,以及磷酸位点的定位和定量分析。随着样品分离技术和相关仪器的发展 ,磷酸蛋白快速、准确、全面分析鉴定将能够实现。

重组人Fab金属螯合层析法纯化条件的研究

在重组人Fab (rhFab)表达载体的羧基端插入六个组氨酸 ,使其对金属螯合层析介质产生特异性吸附 ,可用金属螯合亲和层析法进行分离纯化 .采用自制金属 (铜、锌金属离子 )螯合层析介质 ,以 pH和咪唑两种洗脱方法 ,对rhFab段的纯化效果进行了探讨 .结果显示 :铜离子螯合层析介质比锌离子螯合层析介质对rhFab的亲和能力更强 ;pH洗脱方法的重复性优于咪唑法 ;金属铜离子螯合层析法对rhFab进行一步纯化可得到纯度大于

亲和层析法用于噬菌体抗体库的筛选

本研究报道一种基于固定化金属亲和层析(IMAC)的噬菌体抗体库液相筛选方法。将纯化的带有His标签的抗原与噬菌体抗体库混合,噬菌体抗体与抗原充分结合后再加入亲和介质,使噬菌体抗体抗原复合物通过His标签与介质结合,然后通过充分洗涤去除非特异性噬菌体抗体,最后将特异性噬菌体抗体洗脱下来,感染TG1,进行下一轮筛选。整个筛选过程中抗原与抗体的结合在液相中完成,不仅消除了固相介质对抗原表位的影响,也更有利于噬菌体抗体与抗原的充分作用。将此方法应用于HEV NE2蛋白特异性人源噬菌体抗体的筛选,抗原竞争ELISA,阳性血清阻断,可溶性单链抗体表达检测及测序结果表明,最终获得2个特异性人源抗体。

蛇毒类凝血酶基因在大肠杆菌中的融合表达及纯化

将大连蛇岛蝮蛇毒类凝血酶(Gloshedobin)基因克隆到载体pET32-a(+)上,在T7lac启动子下以N端融合硫氧还蛋白的形式在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,诱导条件为:30℃诱导6 h,IPTG浓度为1 mmol/L.利用固定化金属离子(Ni2+)亲和层析分别对胞内可溶物和变性条件下的包涵体进行纯化.通过SDS-PAGE检测融合蛋白的纯度,采用点杂交和纤维蛋白凝结活性检测分析,显示纯化产物具有较高生物活性.

菜籽源锌螯合肽的制备、纯化和结构解析

采用碱性蛋白酶水解菜籽蛋白制备水解物,运用固定金属亲和层析(IMAC-Zn2+)和葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)层析分离纯化;利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)和电喷雾电离质谱(ESI-MS)鉴定序列;采用EDTA络合滴定法(ECT)、双硫腙比色法(DCM)、原子吸收光谱(AAS)和电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)检测锌螯合率。试验表明:菜籽蛋白的4 h水解物锌螯合潜力最佳;分离该水解物获得3个肽组分(I,Ⅱ和Ⅲ),其中Ⅱ和Ⅲ具有锌螯合能力;进一步分离后分别获得3个(Ⅱ-1,Ⅱ-2,Ⅱ-3)和2个肽组分(Ⅲ-1和Ⅲ-2),组分Ⅱ-3的锌螯合率最高,高于同浓度的谷胱甘肽(GSH)(P<0.05);鉴定Ⅱ-3序列获得4条肽,即Ala-Arg(AR),Asn-Ser-Met(NSM),Gly-Lys-Arg(GKR)和Glu-Pro-SerHis(EPSH)。其中NSM的锌螯合率最高,来源于菜籽蛋白NADH-enoyl-ACP reductase Chain A序列中的296-298氨基酸残基。因此,菜籽蛋白可以作为微量元素螯合肽的优良来源。

蛋白折叠液相色谱法复性和纯化大肠杆菌表达的重组人粒细胞集落刺激因子

用蛋白折叠液相色谱法(PFLC)对大肠杆菌表达的包涵体形式的重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)进行了复性并同时纯化。用Cu2+-亚氨基二乙酸(IDA)Sepharose作为固定化金属离子亲和色谱的固定相。在低浓度脲存在下,以咪唑为洗脱剂,采用线性梯度洗脱rhG-CSF。该法仅通过一步PFLC分离,减少了复性过程中rhG-CSF的聚集,复性后的rhG-CSF的比活性为1.8×108IU/mg,纯度为97%,质量回收率为32%。

固定化金属亲和层析胶与亲和层析膜纯化rhMn-SOD和rhCu,Zn-SOD的比较研究

为比较固定化金属亲和层析膜与亲和层析胶的纯化效果,分别用固定化金属亲和层析胶Cu2+柱、Ni2+柱、固定化金属亲和层析膜Cu2+柱、Ni2+柱分离纯化rhCu,Zn-SOD、rhMn-SOD/24a、rhMn-SOD/28。结果表明,亲和胶与亲和膜分离SOD获得相似的纯化效果,纯化倍数均在3到5之间,亲和膜分离所得SOD比活略高于亲和胶,rhCu,Zn-SOD与Cu2+的亲和能力高于rhMn-SOD。固定化金属亲和层析膜色谱为基因工程产物的快速分离鉴定提供了一个简便的方法。