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小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白(Imp)基因的克隆和分子特性分析 被引量:5
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作者 顾沛雯 吴云锋 +1 位作者 王海妮 安凤秋 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期405-411,共7页
【目的】探讨小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白在介体-病原-寄主互作的分子机理。【方法】通过植原体免疫膜蛋白基因序列两侧的保守区设计引物对Imp1051/Imp2265,用PCR方法扩增小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白基因;对扩增片段的最大开放阅读框和基因... 【目的】探讨小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白在介体-病原-寄主互作的分子机理。【方法】通过植原体免疫膜蛋白基因序列两侧的保守区设计引物对Imp1051/Imp2265,用PCR方法扩增小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白基因;对扩增片段的最大开放阅读框和基因的同源矩阵、系统发育树分析;对克隆基因所编码蛋白进行跨膜区、亲疏水区和前导信号序列分析。【结果】从小麦蓝矮病病株和接种长春花中均扩增到约1.0kb的特异片段,其中小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白基因长495bp,推导的编码蛋白含有164个氨基酸。与10种植原体的免疫膜蛋白基因进行序列同源性分析,小麦蓝矮与三叶草绿变植原体同源性最高,核苷酸和编码的氨基酸序列的同源率分别为98.4%和95.1%。蛋白质结构分析结果表明:小麦蓝矮免疫膜蛋白N端有一个跨膜的前导信号序列,C端为跨膜锚定区,中间为膜外亲水区。【结论】小麦蓝矮植原体与三叶草绿变、翠菊黄化、洋葱黄化和泡桐丛枝植原体的免疫膜蛋白为同型蛋白。 展开更多
关键词 小麦蓝矮植原体 免疫膜蛋白基因 同源性 蛋白结构
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植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达 被引量:2
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作者 柴化建 赵海泉 +1 位作者 张丽君 罗焕亮 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期106-110,共5页
旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及I... 旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。 展开更多
关键词 植原体 免疫主导膜蛋白 原核表达
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枣疯植原体免疫优势膜蛋白基因imp-DZ的克隆与原核表达 被引量:2
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作者 董雅容 杨静 +4 位作者 宁钧晖 王进忠 王合 田国忠 任争光 《北京农学院学报》 2021年第1期22-26,共5页
【目的】为了解枣疯植原体免疫优势膜蛋白的特征,并进行初步表达。【方法】对北京农学院农业农村部华北都市农业重点实验室测得的枣疯植原体JWB-Dongzao免疫优势膜蛋白基因imp-DZ序列进行一致性、进化树和蛋白信号肽与跨膜区分析,分别... 【目的】为了解枣疯植原体免疫优势膜蛋白的特征,并进行初步表达。【方法】对北京农学院农业农村部华北都市农业重点实验室测得的枣疯植原体JWB-Dongzao免疫优势膜蛋白基因imp-DZ序列进行一致性、进化树和蛋白信号肽与跨膜区分析,分别设计引物扩增完整imp-DZ序列和去除跨膜区编码序列,克隆到蛋白表达载体pBM30上进行原核表达。【结果】imp-DZ基因序列大小为459 bp,编码152个氨基酸,除与枣疯植原体Jwb-nky中一个编码假定蛋白的基因一致性达到96%之外,与其他植原体imp基因核苷酸和氨基酸序列一致性均低60%。枣疯植原体JWB-Dongzao的imp-DZ与16SrV组其他成员imp基因聚在一个分支。携带Imp-DZ跨膜区的重组菌无法表达该蛋白,去掉跨膜区后蛋白得到大量表达。【结论】该研究成功表达了枣疯植原体的免疫优势膜蛋白Imp-DZ,证实了跨膜区影响其在大肠杆菌中的表达,为下一步制备该蛋白抗血清和探索植原体与寄主植物互作机制提供依据。 展开更多
关键词 枣疯病 植原体 免疫优势膜蛋白 异源表达
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The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins 被引量:4
4
作者 Yuan He Kan Wang Nieng Yan 《Protein & Cell》 SCIE CAS CSCD 2014年第9期658-672,共15页
Eukaryotic membrane proteins, many of which are key players in various biological processes, constitute more than half of the drug targets and represent important candidates for structural studies. In contrast to thei... Eukaryotic membrane proteins, many of which are key players in various biological processes, constitute more than half of the drug targets and represent important candidates for structural studies. In contrast to their physiological significance, only very limited number of eukaryoUc membrane protein structures have been obtained due to the technical challenges in the genera- tion of recombinant proteins. In this review, we examine the major recombinant expression systems for eukaryotic membrane proteins and compare their relative advantages and disadvantages. We also attempted to summarize the recent technical strategies in the advancement of eukaryotic membrane protein purification and crystallization. 展开更多
关键词 eukaryotic membrane proteins recombinant expression structural biology integralmembrane proteins (imps) fluorescence detected sizeexclusion chromatography (FSEC) protein purification and crystallization
原文传递
问号钩端螺旋体主要外膜蛋白免疫功能表位及其致炎作用的研究 被引量:3
5
作者 徐丽慧 严杰 +1 位作者 阮萍 毛亚飞 《浙江大学学报(医学版)》 CAS CSCD 2005年第1期9-14,共6页
目的 :了解问号钩端螺旋体 (简称钩体 )主要外膜蛋白 Omp L 1、Lip L 32和 L ip L 4 1免疫功能表位及其致炎作用。方法 :建立 Ni- NTA亲和层析法 ,提取不同基因型表达的目的重组蛋白 r Omp L1/ 1和 Omp L1/ 2、L ip L32 / 1和 r Lip L32... 目的 :了解问号钩端螺旋体 (简称钩体 )主要外膜蛋白 Omp L 1、Lip L 32和 L ip L 4 1免疫功能表位及其致炎作用。方法 :建立 Ni- NTA亲和层析法 ,提取不同基因型表达的目的重组蛋白 r Omp L1/ 1和 Omp L1/ 2、L ip L32 / 1和 r Lip L32 / 2、Lip L4 1/ 1和 r Lip L4 1/ 2。采用 SDS- PAGE检测上述目的重组蛋白的表达情况和提取物纯度。分别采用 Signal P3.0预测服务器 Signal P- NN软件、Propred MHC class- binding peptide prediction- Pro Pred预测服务器 EMBOSS软件 ,对上述蛋白的信号肽、MHC- 类分子结合肽和 B细胞表位进行分析。以人脐静脉内皮细胞株EVC- 30 4为效应细胞 ,采用 EL ISA检测上述目的重组蛋白诱导人脐静脉内皮细胞 EVC- 30 4分泌 IL - 1、IL - 8和TNF- α的作用。结果 :在 IPTG诱导下 ,所构建的原核表达系统可有效表达 r Omp L1/ 1和 r Omp L1/ 2、r Lip L32 / 1和r Lip L32 / 2、r L ip L4 1/ 1和 r Lip L4 1/ 2 ,其产量分别约占细菌总蛋白的 30 %和 15 %、4 0 %和 35 %、15 %和 10 %。提纯后的目的重组蛋白 SDS- PAGE后均仅见单一的蛋白条带。Omp L1s、Lip L32 / 1和 Lip L32 / 2、Lip L4 1s的信号肽分别位于 N端 1- 2 4、1- 2 1和 1- 2 4、1- 2 4位氨基酸残基。 Omp L 1s。 展开更多
关键词 钩端螺旋体 问号/致病力 细菌外膜蛋白/致病力 免疫显性表位/分析 细胞因子
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花生丛枝植原体免疫膜蛋白基因克隆及细菌双杂交诱饵质粒构建
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作者 杨文君 张雨良 +3 位作者 王健华 余乃通 林湛松 刘志昕 《植物研究》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期429-435,共7页
初步分析植原体免疫膜蛋白的结构,以Imp构建诱饵质粒,为研究植原体与寄主互作的分子机理,探讨植原体传播、侵染及在寄主内的运输方式奠定基础。根据本实验室获得的花生丛枝植原体免疫膜蛋白基因序列设计特异性引物Imp-F/Imp-R,通过PCR... 初步分析植原体免疫膜蛋白的结构,以Imp构建诱饵质粒,为研究植原体与寄主互作的分子机理,探讨植原体传播、侵染及在寄主内的运输方式奠定基础。根据本实验室获得的花生丛枝植原体免疫膜蛋白基因序列设计特异性引物Imp-F/Imp-R,通过PCR扩增获得花生丛枝植原体免疫膜蛋白基因,大小519 bp,编码蛋白含有172个氨基酸残基,与SPWB膜蛋白的核苷酸差异一个碱基,氨基酸序列相同。另外与WBDL膜蛋白的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.8%和70.2%。对其进行系统发育树分析;初步分析imp基因编码蛋白的跨膜区和疏水区。分析结果表明:花生丛枝植原体免疫膜蛋白C端有一跨膜锚定区,N端主要为膜内亲水区,没有前导信号序列。预测花生丛枝植原体免疫膜蛋白是一类C端跨膜的植原体免疫膜蛋白。将imp基因克隆到带有λcI基因的pBT质粒上,构建诱饵载体pBT-Imp,并通过IPTG诱导表达,western blot检测和自激活检验对其进行检测。结果显示:所构建的诱饵载体pBT-Imp可用于细菌双杂交的进一步实验。 展开更多
关键词 花生丛枝植原体 免疫膜蛋白 细菌双杂交 诱饵载体
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植原体免疫主导膜蛋白A的原核表达载体构建、表达及其抗血清制备 被引量:1
7
作者 梁楠楠 张丽君 +4 位作者 赵海泉 刘仲健 罗焕亮 林彦星 刘宵宵 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期625-628,共4页
目的构建植原体免疫主导膜蛋白A(IdpA)的原核表达载体,表达并纯化目的蛋白,制备抗血清。方法以重组克隆质粒pMD18-T-IdpA为模板PCR扩增IdpA基因片段,经酶切连接将IdpA基因克隆到原核表达载体pET-28a(+),重组质粒转化感受态E.coli BL21(D... 目的构建植原体免疫主导膜蛋白A(IdpA)的原核表达载体,表达并纯化目的蛋白,制备抗血清。方法以重组克隆质粒pMD18-T-IdpA为模板PCR扩增IdpA基因片段,经酶切连接将IdpA基因克隆到原核表达载体pET-28a(+),重组质粒转化感受态E.coli BL21(DE3),PCR和双酶切进行鉴定。IPTG诱导重组菌表达IdpA蛋白,并进行纯化和鉴定,以纯化获得的IdpA蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠制备抗血清,并采用ELISA和Western blot法检测抗血清的效价和特异性。结果成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-IdpA,并在大肠杆菌中能稳定表达IdpA蛋白,经纯化获得了纯度大于90%的高纯度目的蛋白,用纯化的IdpA蛋白免疫BALB/c小鼠,获得了效价高于1∶320 000的强特异性抗IdpA蛋白抗血清。结论成功进行了IdpA的原核表达并制备了抗血清。 展开更多
关键词 植原体 免疫主导膜蛋白 原核表达 重组蛋白IdpA 抗血清
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幽门螺杆菌外膜蛋白Omp18免疫优势表位的预测与鉴定 被引量:1
8
作者 卿蕊 向晴可 +2 位作者 刘众齐 肖非 阳帆 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第12期1783-1787,共5页
目的:分析预测幽门螺杆菌(Hp)外膜蛋白Omp18的免疫优势表位,并进一步验证确定其免疫优势片段的免疫原性。方法:通过生物信息学软件DNAStar分析预测幽门螺杆菌外膜蛋白Omp18的潜在优势表位,并由北京赛百盛基因技术有限公司合成相应的优... 目的:分析预测幽门螺杆菌(Hp)外膜蛋白Omp18的免疫优势表位,并进一步验证确定其免疫优势片段的免疫原性。方法:通过生物信息学软件DNAStar分析预测幽门螺杆菌外膜蛋白Omp18的潜在优势表位,并由北京赛百盛基因技术有限公司合成相应的优势片段;片段通过口服免疫的方式免疫接种雌性BALB/c小鼠,每周1次共免疫4次。末次免疫10 d后处死小鼠,取血清检测IgG、IgA水平,取肠道灌洗液检测sIgA水平;取小鼠脾细胞ELISA法检测细胞上清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6水平,并通过MTT比色法检测脾细胞增殖情况;末次免疫10 d后Hp标准株攻击小鼠2次,4周后处死小鼠,取胃组织进行快速尿素酶实验,并计算每组的感染率。结果:ELISA法检测各片段免疫小鼠血清IgG、IgA以及肠道sIgA水平均高于对照组,且差异有显著统计学意义(P<0. 05);各免疫组脾细胞上清INF-γ、IL-2水平均显著高于对照组(P<0. 05),而IL-4、IL-6水平较对照组则差异无显著统计学意义(P>0. 05);MTT比色法结果显示各片段刺激后小鼠淋巴细胞均有显著增殖(P<0. 05);快速尿素酶实验结果提示各片段免疫后均能显著减少小鼠胃组织中Hp的感染(P<0. 05)。结论:通过生物信息学软件分析预测的外膜蛋白Omp18优势片段均具有较好的免疫原性,且对Hp感染有一定的保护作用。 展开更多
关键词 幽门螺杆菌 外膜蛋白 Omp18 优势片段
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小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白(Imp)的跨膜区影响其在大肠杆菌中的表达 被引量:2
9
作者 孙润红 于祥泉 +4 位作者 陶烨 杨洋 吴云锋 张银武 李艳 《植物病理学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期587-592,共6页
根据跨膜区预测结果,设计ImpF1/ImpR1和ImpF2/ImpR2两对特异性引物。以ImpF1/ImpR1,ImpF1/ImpR2,Imp-F2/ImpR1和ImpF2/ImpR2共4个组合经PCR扩增得到4个目标片段,即:免疫膜蛋白Imp基因的全长(Imp-B);切除C-端跨膜区的Imp基因的基因序列(I... 根据跨膜区预测结果,设计ImpF1/ImpR1和ImpF2/ImpR2两对特异性引物。以ImpF1/ImpR1,ImpF1/ImpR2,Imp-F2/ImpR1和ImpF2/ImpR2共4个组合经PCR扩增得到4个目标片段,即:免疫膜蛋白Imp基因的全长(Imp-B);切除C-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-N);切除N-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-C);切除N-和C-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-S)。经酶切连接到原核表达载体Pmal-c2x,并转入E.coliBL21(DE3)PlysS菌株中。SDS-PAGE电泳验证,只有切除N-、C-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-S)得到大量表达,结果表明:小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白的跨膜区影响其在大肠杆菌中的表达。根据跨膜区预测结果,设计ImpF1/ImpR1和ImpF2/ImpR2两对特异性引物。以ImpF1/ImpR1,ImpF1/ImpR2,Imp-F2/ImpR1和ImpF2/ImpR2共4个组合经PCR扩增得到4个目标片段,即:免疫膜蛋白Imp基因的全长(Imp-B);切除C-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-N);切除N-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-C);切除N-和C-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-S)。经酶切连接到原核表达载体Pmal-c2x,并转入E.coliBL21(DE3)PlysS菌株中。SDS-PAGE电泳验证,只有切除N-、C-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-S)得到大量表达,结果表明:小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白的跨膜区影响其在大肠杆菌中的表达。 展开更多
关键词 小麦蓝矮植原表体 免疫膜蛋白 跨膜区
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HIV-1多表位膜蛋白在E.coli中的表达及在血清检测中的应用 被引量:2
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作者 韩保光 孟莉 +3 位作者 马贤凯 宋晓国 王鸿雁 凌世淦 《军事医学科学院院刊》 CSCD 北大核心 1998年第1期8-12,共5页
目的:获得具有较多保守抗原表位的HIV-1膜重组抗原,提高HIV筛选ELISA试剂的质量。方法:利用分子克隆与PCR方法,获得了新的HIV-1膜重组抗原的基因克隆,编码gp120C端亲水区37个氨基酸残基(env48... 目的:获得具有较多保守抗原表位的HIV-1膜重组抗原,提高HIV筛选ELISA试剂的质量。方法:利用分子克隆与PCR方法,获得了新的HIV-1膜重组抗原的基因克隆,编码gp120C端亲水区37个氨基酸残基(env482~518)以及gp41膜外部分的128个氨基酸残基(env548~675)。将该基因克隆到pGEMEX-1载体上融合表达,表达蛋白经纯化后,以1μg/ml的浓度包被ELISA板,用来检测卫生部药品生物制品检定所提供的HIV-1标准血清。结果:在大肠杆菌中有效表达了新的重组HIV-1膜抗原,表达产物以包涵体的形式存在,提取包涵体后,通过制备电泳将重组蛋白纯化。单独使用该抗原建立的间接ELISA分析,可以检测出标准血清中所有的11份阳性血清;而与标准血清中的28份阴性血清均无交叉反应。结论:重组膜抗原由于含盖了HIV膜抗原的主要表位,是HIV-1ELISA筛选分析的良好试剂。 展开更多
关键词 艾滋病毒1型 膜蛋白 基因表达 抗原优势表达
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植原体膜蛋白研究进展
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作者 蔡金宏 崔凤超 +2 位作者 泰尔格力 徐畅 王克华 《植物生理学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第10期1879-1887,共9页
植原体是一种无细胞壁的植物病原细菌,分布广泛,对世界上1 000多种植物都会造成影响。植原体主要是通过刺吸式口器昆虫如飞蝉等的唾液腺传播,而植原体膜蛋白是主要的致病因子,会直接作用于宿主。目前尚不清楚免疫膜蛋白与宿主的互作机... 植原体是一种无细胞壁的植物病原细菌,分布广泛,对世界上1 000多种植物都会造成影响。植原体主要是通过刺吸式口器昆虫如飞蝉等的唾液腺传播,而植原体膜蛋白是主要的致病因子,会直接作用于宿主。目前尚不清楚免疫膜蛋白与宿主的互作机制。本文综述了植原体形态特征、传播途径、基因组分类,尤其是植原体膜蛋白方面的近期研究进展,并对今后植原体膜蛋白的研究趋势进行了展望。 展开更多
关键词 植原体 16S rRNA 膜蛋白 免疫显性膜蛋白 致病因子
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