草鱼的两种新型免疫球蛋白基因IgZ-2和IgM-IgZ

在草鱼中新发现的两种免疫球蛋白重链的cDNA和基因组序列,其中的一种IgZ命名为IgZ-2,以区别于已报道的IgZ,另一种只有两个恒定区,一个恒定区与IgM相似而另一个与IgZ相似,这一特征与已报道的鲤的IgM-IgZ相似,故同样称为IgM-IgZ。分泌型IgZ-2的cDNA序列包含1889bp,编码539个氨基酸,其3'编码区包含267bp,但缺乏5'非编码区及部分可变区序列。分泌型IgM-IgZ的cDNA全长为1316bp,编码361个氨基酸,其5'非编码区包含3bp,3'非编码区包含227bp。膜结合型IgM-IgZ由两个膜外显子与CH2中的一个剪切位点剪切而成。氨基酸序列比对结果显示IgZ-2和IgM-IgZ的恒定区存在保守的半胱氨酸。系统进化树分析显示,草鱼IgZ-2以较高的支持率与斑马鱼IgZ聚为一枝,再与草鱼IgZ、草鱼IgM-IgZ和鲤IgM-IgZ这一枝聚为一类。用半定量RT-PCR检测IgZ-2和IgM-IgZ在4条草鱼的器官/组织中的表达,发现分泌型IgZ-2、分泌型IgM-IgZ和膜结合型IgM-IgZ在4条鱼中的表达存在个体差异,但主要都在免疫器官中表达。

斜带石斑鱼IgM、IgZ和IgD重链基因的克隆

应用RACE方法获得斜带石斑鱼膜结合型免疫球蛋白M（membrane-bound immu-noglobulin M,mIgM）,膜结合型免疫球蛋白D（mIgD）,分泌型免疫球蛋白Z（secretory immu-noglobulin Z,sIgZ）的重链基因。斜带石斑鱼膜结合型IgM重链恒定区包含3个恒定区结构域（μ1,μ2,μ3）以及两个跨膜外显子（TM1,TM2）,TM1外显子与μ3结构域末端相连接。氨基酸序列相似性分析结果显示,斜带石斑鱼mIgM各恒定区与牙鲆mIgM恒定区相似性最高,为53%-78%。mIgD的cDNA全长为3 375 bp,开放阅读框包含3 006 bp,其恒定区由1个μ1外显子,7个δ外显子以及跨膜区组成。斜带石斑鱼IgD恒定区与鳜IgD各恒定区氨基酸序列相似性最高,δ1-δ7的相似性分别为75.5%、75.8%、65.4%、76.6%、88.1%、90.6%、82.8%,TM结构域为82.7%。sIgZ的基因结构与其他硬骨鱼类sIgZ的结构相似,包括4个外显子和3个内含子,内含子长度分别为222、129和458 bp。利用半定量PCR分别检测了这3种基因在斜带石斑鱼各器官/组织中的表达,发现mIgM在头肾、肾脏、脑、脾脏、肠、鳃、心脏和胸腺中均有表达;mIgD的mRNA在头肾、肾脏以及胸腺中有较高的表达,在肠中表达量较低;sIgZ mRNA主要分布于淋巴组织如头肾、肾及脾脏中,而在鳃、心脏和胸腺中的丰度较低。

斜带石斑鱼IgZ重链基因的表达纯化和抗体制备

为获得斜带石斑鱼IgZ重链基因的多克隆抗体,成功构建了斜带石斑鱼免疫球蛋白IgZ重链重组蛋白表达质粒pQE30/IgZ,将其转化到大肠杆菌表达菌株M15中,确定了最佳诱导表达条件:IPTG 0.2 mmol/L,诱导温度30℃,诱导时间6 h。所获得的IgZ重链重组蛋白经Ni-NTA亲和层析后,纯度达到85%以上;以纯化的IgZ重链重组蛋白为抗原免疫新西兰兔,制备出相应的多克隆抗体,经ELISA测定抗血清效价约为1∶320 000。