猪圆环病毒2型免疫过氧化物酶单层细胞试验抗体检测试剂盒的研制及应用

本研究建立了一种免疫过氧化物酶单层细胞试验(Immunoperoxidase monolayer assay,IPMA),用于猪圆环病毒2型血清抗体检测,通过对IPMA反应条件的优化,组装了诊断试剂盒。研究结果表明,用IPMA检测猪圆环病毒2型人工感染猪血清,于感染后3周抗体阳转,第3周～10周抗体阳性检出率为92.8%(52/56),对照组猪血清抗体检测均为阴性(33/33)。试剂盒在-20℃稳定保存18个月与其他几种猪病毒参考血清无交叉反应,与用重组蛋白抗原建立的rcELISA符合率为89.2%。对来自黑龙江、吉林、河北、上海、内蒙古、云南、江西等地猪场健康成年猪血清480份和发病猪血清424份进行了检测,抗体检出率分别为91.7%和79.2%,表明我国猪群中猪圆环病毒2型污染相当严重。该试剂盒的研制为我国PCV2流行病学调查和疫苗免疫效果的评价提供了技术手段。

PRRSV-IPMA抗体检测试剂盒的研制及其应用

建立了一种检测猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验法（IPMA），并组装成PRRSV-IPMA抗体检测试剂盒。对该试剂盒的敏感性、特异性、重复性及保存期等进行了试验，并与国外IDEXX ELISA试剂盒进行了比较。结果显示，用该试剂盒检测PRRSV人工接种猪血清样品，第1周抗体阳性检出率为50％，从第2周起抗体阳性检出率均为100％，而对照组猪血清抗体检测均为阴性。该试剂盒重复性好，-20℃保存18个月稳定，与其他病毒参考血清无交叉反应，与国外IDEXX ELISA试剂盒的符合率为83．3%。用该试剂盒对采自黑龙江、吉林、辽宁、河北、上海等地13个猪场的520份正常猪血清样品进行了抗体检测，结果，4个猪场阳性率高达90％以上，仅有2个猪场为阴性，其余猪场阳性率为10％～57%。

猪圆环病毒1型抗体IPMA检测方法的建立及应用

建立了一种用于检测猪圆环病毒1型(PCV1)血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)方法。对该方法的反应条件、特异性、敏感性及重复性等进行了系统试验,并与用昆虫杆状病毒表达的PCV1-Cap重组蛋白抗原建立的间接ELISA的检测结果进行了比较。结果显示,用IPMA法对已知PCV1和猪圆环病毒2型(PCV2)参考阳性血清进行检测,血清稀释度≥1∶100即可消除2种病毒间的低水平交叉反应,与其他几种猪病毒参考阳性血清无交叉反应;与用昆虫杆状病毒表达的PCV1-Cap重组蛋白抗原建立的间接ELISA的检测符合率为88.9%。用该方法对黑龙江省、吉林省、河北省、上海市、辽宁省等地猪场送检的257份血清样品进行检测,PCV1和PCV2血清抗体阳性检出率分别为19.1%和80.5%,PCV1抗体阳性猪中有95.9%为PCV2阳性,表明我国猪群已存在PCV1感染,在临床上PCV1与PCV2多以混合感染形式存在。建立的PCV1-IPMA方法具有操作简便、特异和敏感等特点,不失为PCV1流行病学调查及血清抗体检测的有效技术手段。

草鱼呼肠孤病毒HZ08株抗体IPMA检测方法的建立及应用

为建立一种检测草鱼呼肠孤病毒HZ08株(HZ08)抗体的免疫学方法,本实验以接种HZ08病毒的细胞培养板为抗原板,以免疫弱毒疫苗的草鱼血清为抗体,通过反应条件优化,建立了检测GCRV HZ08血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞实验(IPMA)方法,并对该方法特异性、敏感性、重复性、与ELISA检测结果的符合率及对临床血清样品的检测效果等进行了验证。结果显示,HZ08株种毒按照1×103拷贝/μL浓度接种后72h固定,HRP-Ig G二抗1∶1000稀释,待检血清1∶100稀释时效果最佳;该IPMA方法与草鱼阴性血清、免疫细菌三联疫苗的草鱼血清、感染GCRV JX0901(GCRVⅠ型)的草鱼血清无交叉反应;GCRV HZ08株阳性血清稀释至1∶800时仍能检出;批内和批间重复性实验显示,该方法具有良好的重复性;符合性实验结果显示,该IPMA方法与ELSIA方法的阳性和阴性符合率分别为95.7%和87.5%;用建立的IPMA方法检测草鱼出血病弱毒疫苗免疫草鱼,免疫2周后抗体水平达到峰值;对现地送检的126份草鱼血清样本进行检测,平均检出阳性率为72.2%。研究表明,建立的HZ08株IPMA方法特异性强、重复性好、敏感性高,为GCRVⅡ型的流行病学调查、疫苗免疫效果评价及抗原抗体检测提供了一种有效的检测手段。

PRV-IPMA抗体检测试剂盒的研制及其应用

本研究建立了一种免疫过氧化物酶单层细胞试验法(IPMA),用于猪伪狂犬病病毒(PRV)血清抗体检测。通过对IPMA反应条件的优化,组装成PRV-IPMA诊断试剂盒,并对该试剂盒检测的敏感性、特异性、重复性及保存期等进行了试验。结果表明,IPMA检测相对于SN的敏感性为96.2%,特异性为97.7%,两者的总符合率为96.9%;该试剂盒检测的重复性好,与其它病毒参考血清无交叉反应;试剂盒可在-20℃保存12个月,用该试剂盒检测PRV人工感染猪血清,于感染后2周抗体全部阳转,健康对照组猪血清抗体检测均为阴性结果。对来自黑龙江、吉林、上海、内蒙古、河北等地采集的5个猪场后备母猪150份血清样本进行检测,PRV血清抗体阳性检出率为16.7%～50%。检测结果表明这些猪场后备猪群仍需加强疫苗免疫。该试剂盒的研制为我国PRV流行病学调查和疫苗免疫效果的评价提供了技术手段。

猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫过氧化物酶单层细胞检测方法的建立

【目的】建立一种可直观判断猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的检测方法。【方法】应用PRRSV多抗血清作为一抗,建立了PRRSV免疫过氧化物酶单层细胞检测体系,并对相关反应条件进行优化,对其特异性和敏感性进行检测。【结果】最佳病毒接种感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.1,最佳感染时间为24 h,一抗最佳稀释度为1∶1000,所建立的PRRSV免疫过氧化物酶单层细胞检测方法与其他几种流行猪病无交叉反应。对300份来自不同地区的临床血清进行检测,IPMA与PCR检测阳性符合率达93%。【结论】该方法具有良好的特异性和敏感性,为PRRSV的临床检测提供新方法。

猪流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备猪流感病毒(SIV)核蛋白(NP)的单克隆抗体(MAb),采用差速离心法纯化H1N1和H3N2亚型SIV后交叉免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过建立的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)单克隆抗体检测方法进行筛选。获得3株能稳定分泌抗NP蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为16D5、18G8和20C4,将它们诱导小鼠产生的腹水IPMA效价分别为1×10^-6、1×10^-6和1×10^-5。亚型鉴定结果显示,3株单克隆抗体的重链均为IgG1,轻链为κ链。3株单克隆抗体特异识别H1N1、H3N2、H5N1、H7N9和H9N2亚型流感病毒,并且与猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒无交叉反应。Westernblot检测结果表明,3株杂交瘤细胞培养上清均在56ku附近出现一条特异性的蛋白质条带,说明针对SIV的NP蛋白制备了3株单克隆抗体。综上,成功制备了针对SIVNP蛋白的3株单克隆抗体,可识别不同亚型的SIV。

鸡新城疫病毒中和单克隆抗体的制备及鉴定

采用差速离心法纯化鸡新城疫病毒(NDV)标准毒株F48E8,免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤细胞技术制备抗NDV单克隆抗体,旨在为NDV中和抗原表位分析奠定基础。将NDV感染BHK-21细胞,建立异源免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)的单克隆抗体检测方法,筛选获得14株分泌抗NDV单克隆抗体杂交瘤细胞株,其单克隆抗体腹水IPMA效价均在0.50×10-2~2.56×10-5(F48E8株和La Sota株)。血凝抑制试验(HI)结果表明,单克隆抗体1G6、2C1、4D2、5F2和13A5具有血凝抑制活性,其HI效价在(6~12)log2(F48E8株)和(9~11)log2(La Sota株)。病毒中和试验结果表明,单克隆抗体5F2和13A5对F48E8株和La Sota株均有明显的病毒中和活性,中和效价分别为1∶400~1∶800和1∶25。夹心ELISA结果表明,单克隆抗体5F2识别NDV HN蛋白,13A5识别F蛋白。综上,成功制备了具有中和活性的NDV单克隆抗体(5F2和13A5)。

猪细小病毒中和性单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备具有中和活性的抗猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)单克隆抗体,采用血凝试验(HA)鉴定纯化的重组PPV VP2蛋白的活性,将重组VP2蛋白与弗氏佐剂混合后免疫BALB/c小鼠。免疫3次后,小鼠血清的血凝抑制(HI)效价可达1∶2^(16),取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合制备杂交瘤细胞,采用有限稀释法进行多轮亚克隆,经免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)筛选,成功获得杂交瘤细胞株5F7和11B3,能够稳定分泌中和性单克隆抗体。单克隆抗体5F7和11B3的轻链型均为Kappa,重链型分别为IgG2a和IgG2b。经ELISA和IPMA检测,单克隆抗体5F7和11B3均能与重组PPV VP2蛋白和PPV病毒粒子发生特异反应,而与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)无交叉反应。5F7和11B3腹水针对PPV病毒反应的ELSIA效价分别为1∶10 240和1∶20 480;针对PPV感染PK15细胞的中和效价分别为1∶2^(11)和1∶2^(10)。Western blot鉴定结果显示,单克隆抗体5F7和11B3均不与变性的VP2蛋白发生反应,说明2株单克隆抗体均识别重组PPV VP2蛋白的构象型表位。综上,成功制备了2株具有中和活性的抗PPV单克隆抗体。

犬细小病毒2c亚型毒株的分离与鉴定

采集一疑似犬细小病毒(CPV)患犬的粪便,用纳米PCR方法对病料进行CPV检测,并应用猫肾细胞F81进行病毒分离培养,采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测病毒在F81细胞中的增殖动态。利用PCR扩增分离病毒的VP2基因,测序结果用DNAMAN软件对获得的VP2基因序列进行拼接,并与NCBI上已经公布的犬细小病毒的全基因组序列以及相关蛋白的核酸序列进行比较,确定其所分离的病毒株型并推导氨基酸序列。结果表明,纳米PCR检测结果为CPV核酸阳性,病料接种到F81细胞培养后出现明显细胞病变(CPE),血清学鉴定为CPV抗原阳性,序列测定分析表明,该毒株VP2基因开放阅读框(ORF)为1755 bp。进化分析显示,该毒株属于CPV-2c型,并命名为CPV-2c-Guangxi23。

猪传染性胃肠炎病毒免疫过氧化物酶单层细胞试验原位检测方法的建立

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的原位检测方法,本研究以TGEV N蛋白的单克隆抗体为一抗,羊抗小鼠IgG-HRP为二抗,AEC过氧化物酶底物为显色液,建立了TGEV的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)检测方法。检测结果显示,一抗的最佳使用浓度为0.5 ng/μL,二抗的最佳稀释倍数为1∶2 000倍,经AEC显色,TGEV感染的阳性细胞呈红棕色;对常见的猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒和猪圆环病毒2型等猪病病原检测均为阴性,具有良好特异性;同时该方法能够在普通显微镜下观察到病毒在细胞中的分布情况。本研究建立的方法为TGEV的实验室鉴定及TGEV在感染细胞中的定位和动态分布提供有效的检测手段。

1株犬细小病毒的分离鉴定及其生物学特性研究

采集一疑似犬细小病毒(CPV)患犬的粪便,采用胶体金试纸条和PCR方法对病料进行CPV检测,并应用猫肾细胞F81进行病毒分离培养,分别采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)和PCR检测病毒在F81细胞中的增殖动态,采用无血清培养和有血清培养2种方法进行体外培养,IPMA测定病毒滴度。利用PCR扩增分离病毒的VP2基因,经序列测定后采用DNAStar 7.0和MEGA 5.0软件进行生物信息学分析。结果表明,胶体金试纸条检测为CPV抗原阴性,PCR检测结果为CPV核酸阳性,病料接种到F81细胞培养后出现明显细胞病变(CPE),血清学鉴定为CPV抗原阳性,将分离得到的病毒命名为CPV-NY130615。IPMA可从感染后6 h的F81细胞中检出病毒,PCR能从感染后6 h培养上清中检出CPV核酸。血清同步接种培养法培养和无血清单层接种培养法培养的第15代病毒滴度分别为1×108.06TCID50/m L和1×107.65TCID50/m L。序列测定分析表明,该毒株VP2基因开放阅读框(ORF)为1 755 bp,编码584 aa。进化分析显示,该毒株属于CPV-2a型。

1株猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定及其生物学特性研究

采集1例疑似感染猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)仔猪的粪便,运用RT-PCR方法和血清学方法对病料进行TGEV检测,并应用猪睾丸细胞(ST)进行病毒分离培养,分别采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)和RT-PCR方法检测病毒在ST细胞中的增殖动态,应用RT-PCR方法扩增分离TGEV S1基因,经序列测定后,采用DNAStar 7.0和Mega 5.0软件对TGEV进行生物信息学分析。结果表明,病料接种到ST细胞培养后,出现明显细胞病变效应(CPE);RT-PCR检测结果显示,TGEV核酸阳性;血清学鉴定TGEV抗原阳性。将分离毒株命名为TGEV-NY。感染12 h后,IPMA检测结果阳性,且可从细胞培养上清中检出TGEV核酸。序列测定分析表明,分离毒株S1基因开放阅读框(ORF)为2 220 bp,编码740个氨基酸。进化分析显示,分离毒株与我国2006年分离的SC-Y毒株亲缘关系最近,分离毒株属于基因Ⅰ群。

基于SodC单克隆抗体的胞内劳森菌IPMA抗原检测方法的建立及应用

【目的】胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,LI)是引起猪增生性肠炎(porcine proliferative enteritis,PPE)的肠道病原菌,主要表现为动物福利下降,给世界养猪业造成严重的经济损失。研究通过制备鼠抗LI SodC的单克隆抗体,建立一种针对LI的免疫过氧化物酶细胞单层试验(IPMA)抗原检测方法,检验其在临床上的应用性,从而为LI的病原诊断提供一种科学有效的手段。【方法】选取胞内劳森菌弱毒疫苗为研究对象,通过PCR扩增其sodc片段,将其克隆至原核表达载体pGex-6p-1上,成功构建出pGex-6p-1-sodc重组质粒,诱导表达重组蛋白SodC。Western Blot分析重组蛋白的反应原性,一抗使用鼠抗GST标签的抗体。以该重组蛋白为免疫原,免疫4—6周龄BALB/c小鼠,利用常规细胞融合技术、有限稀释法和间接ELISA技术筛选阳性杂交瘤细胞,并制备腹水。通过间接免疫荧光(IFA)鉴定该单抗的特异性。以该单抗为一抗,摸索并建立了LI IPMA抗原检测方法,并评价该方法的特异性、敏感性和重复性。用优化后的IPMA方法对来自江苏周边地区猪场回肠组织样品进行检测,评价该方法的临床价值。【结果】纯化后SodC蛋白浓度较高,与鼠抗GST标签的抗体发生特异性结合,表明该蛋白反应原性较好。经3次亚克隆后最终共筛选获得2株阳性杂交瘤细胞,分别命名为1D6和1F7。单抗亚型鉴定结果显示:1D6亚型为IgA,1F7亚型为IgG3;ELISA检测1D6单抗效价为1﹕1024000;1F7单抗效价为1﹕1024000;间接免疫荧光(IFA)结果表明2株单抗均与LI菌株发生特异性反应,与猪霍乱沙门氏菌(Salmonella Cholerasuis,S.Cholerasuis)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪常见病原无交叉反应。优化后IPMA反应条件为:一抗稀释倍数为1﹕800,作用45min;二抗稀释倍数为1﹕2500,作用1h,此时IPMA检测效果最佳。用该方法检测S.Cholerasuis、PEDV、TGEV、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2(PCV2)均为阴性;最低检测限为103个/mL,说明该方法特异性强、敏感性高。临床样品检测结果显示146份病料中共检测出92份阳性样品,3个不同猪场的阳性样品检出率分别为65.6%、68.2%和53.7%,总体阳性率为63.0%。普通PCR方法检测出82份阳性样品,两种方法的阳性符合率为94.6%。【结论】成功制备了鼠抗LI SodC蛋白的单克隆抗体,建立了针对LI抗原的IPMA检测方法,并对临床样品进行了检测。该方法具有良好的特异性和敏感性,并具有一定的临床价值,为实验室LI的分离鉴定、在感染细胞中的定位以及流行病学调查和相关检疫提供一种有效的技术手段。

H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体IPMA检测方法的建立

本试验旨在建立一种针对检测抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)筛选方法。通过优化MDCK细胞接毒量、细胞接毒后培养时间、封闭液的种类和工作浓度、工作时间等各个反应条件,并对建立的IPMA筛选方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。结果显示,建立的IPMA检测方法的最优反应条件为MDCK细胞接毒10 2.63 TCID 50/100μL H1N1亚型猪流感病毒,37℃培养24 h,含3‰H 2O 2的甲醇室温固定15 min,5%脱脂乳37℃封闭2 h,50μL杂交瘤细胞上清作为一抗,37℃孵育2 h,羊抗鼠HRP-IgG二抗37℃孵育1 h。所建立的IPMA方法能特异性地检测H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪瘟病毒(CSFV)阳性血清不发生交叉反应;其敏感性检测结果显示,可检测1∶3 200的HI=2-9标准H1N1猪阳性血清;批间和批内重复性试验结果较好。综上所述,本试验成功建立了抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的IPMA检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为生产鉴定H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体提供了一种简便、实用、有效的检测手段。

猪伪狂犬病毒变异株HN1201 gB蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为获得用于伪狂犬病毒(PRV)临床检测和实验室研究所需的PRV gB特异性抗体,以PRV变异病毒株PRV HN1201免疫小鼠,取免疫后小鼠脾脏细胞与SP/20细胞融合,制备抗PRV gB蛋白的单克隆抗体。经免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和间接免疫荧光试验(IFA)筛选出1株稳定分泌PRV gB蛋白抗体的单克隆细胞系,经鉴定该细胞系所分泌抗体为IgG1亚型,腹水纯化抗体的IFA效价为2^-11;细胞培养上清和腹水纯化抗体用于Western blot的最佳稀释比分别为1∶50和1∶5000;杂交瘤细胞诱导小鼠腹水的中和效价为1∶25。IPMA、IFA及Western blot试验结果显示,制备的单克隆抗体能特异性识别PRV gB蛋白。

河南省牛肠道病毒的分离、鉴定及流行病学调查

为了解河南省不同地区的牛群是否存在牛肠道病毒(Bovine enterovirus,BEV)感染及其感染情况,以便为BEV感染的防控提供流行病学资料,试验应用吉林大学动物检验检疫教研室建立的检测BEV抗原的双抗体夹心ELISA方法对采自河南省不同地区牛场的363份粪便样品进行检测,并对部分检测为阳性的病料进行病毒的分离培养、电镜观察及免疫学鉴定。将分离得到的阳性病毒毒株接种MDBK细胞后进行BEV 5′UTR基因的RT-PCR扩增及序列测定。结果表明:牛群的BEV感染率高达21.49%,不同地区牛群均存在程度不同的BEV感染率(2.50%～46.67%)。对ELISA检测为阳性的部分粪便样品进行病毒的分离培养、电镜观察及免疫学鉴定,获得了两株BEV毒株(BEV-HeN-YR2、BEV-HeN-YR91)。分离毒株的5′UTR基因序列的RT-PCR扩增产物测序后比对分析,两株BEV毒株均为F种肠道病毒。说明河南省不同地区牛群存在不同程度的BEV感染,且感染的BEV主要为F种。

抗猪瘟病毒中和性单克隆抗体的制备与鉴定

为了获得具有中和活性的抗猪瘟病毒(CSFV)单克隆抗体,分别将CSFV和杆状病毒表达系统表达纯化的CSFV E2蛋白与佐剂混合后免疫BABL/c小鼠,经杂交瘤细胞融合制备抗CSFV单克隆抗体,经过多轮亚克隆和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)筛选,成功获得5D1、8H7、9A1和13B2共4株能够稳定分泌抗CSFV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。4株单克隆抗体轻链均属于κ型,其中5D1、8H7、13B2为IgG1亚型,9A1为IgG2c亚型。间接ELISA检测结果显示,4株单克隆抗体的腹水效价在2.56×10^5~1.02×10^6;IPMA效价分别为6.40×10^4、1.28×10^5、2.56×10^5、1.28×10^5;SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,4株单克隆抗体均能与经原核表达系统及杆状病毒表达系统获得的CSFV E2蛋白发生特异性反应;IPMA检测结果显示,4株单克隆抗体均能与CSFV发生特异性反应,而与牛流行性腹泻病毒(BVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒(PCV2)均无交叉反应。病毒中和试验证实,单克隆抗体13B2具有中和活性,其中和效价为1.28×10^4。综上,成功筛选出4株能够分泌抗CSFV特异性抗体的杂交瘤细胞株,其中单克隆抗体13B2具有中和CSFV感染活性。

抗传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

选取传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV)M41毒株S1蛋白的重要抗原区,RT-PCR扩增选定的S1基因并构建pET-28a-S1重组表达载体,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE以及Western blot结果显示重组S1蛋白表达正确。以纯化的S1蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备并获得了抗IBV M41 S1蛋白的单克隆抗体3D9。免疫过氧化酶单层试验(immunoperoxidase monolayer assay, IPMA)结果显示,单克隆抗体3D9可与IBV M41毒株反应。成功表达了截短的IBV S1蛋白并获得了能识别IBV M41毒株的单克隆抗体,为IBV检测方法的建立奠定了基础。

一例伪狂犬病毒野毒株感染病例的病原学诊断

对一例疑似伪狂犬病毒(PRV)感染病例进行实验室检测和病原的分离培养。采集病猪的脏器,进行PRV gE基因的PCR检测,病料接种非洲绿猴肾细胞(Vero)并传代培养,观察细胞病变效应(CPE),PCR监测第3代、第5代和第7代培养物PRV的gE和gG基因核酸,采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测病毒在Vero细胞中的增殖动态。结果表明,病猪心脏、肺脏和脾脏为PRV gE基因核酸阳性,Vero细胞在接种病毒48 h,变圆、融合;第3代、第5代和第7代培养物中gE和gG基因核酸均为阳性,第7代培养物与PRV阳性血清呈特异性反应,病毒感染后第6 h、Vero细胞中即可检测PRV抗原,第24 h绝大部分细胞呈PRV抗原阳性。该病例为PRV野毒株感染,所分离的PRV毒株对Vero细胞适应力强。