适合早期诊断的非洲猪瘟sIgA抗体量子点免疫层析检测方法建立

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒感染引起的一种烈性猪传染病,其极高的传染性和发病率给养猪产业造成了巨大的经济损失。目前尚无安全有效的ASF疫苗,因此早期监测是防控ASF最重要的解决方案之一。建立敏感、快速的ASF现场即时检验方法,对维护生猪产业繁荣具有重要意义。首先基于氨基和羧基的偶联反应制备量子点微球(quantum dot microsphere,QDM)偶联ASFV重组抗原蛋白p30的检测探针和QDM-兔抗鸡IgY质控探针;接着在检测线和质控线分别固定鼠抗猪IgA-Sc片段抗体和鸡IgY蛋白制备侧向流免疫试纸条;待检动物口腔液中的ASF sIgA抗体经QDM-p30捕获可被固定至T线。将ASFV阳性口腔液以2倍梯度稀释,检测该方法的灵敏度。通过检测其他几种常见猪病病毒验证该方法的特异性。通过检测ASFV阴性和阳性动物的口腔液临床样本评价该方法的临床诊断效能。该方法特异性好,与PRV、CSFV、PRRV不存在交叉反应;灵敏度高,最低检出稀释度可达1∶64;耗时短,可在20 min内完成检测;操作便捷,无需侵入式采样;检出时间早,人工感染最早可于感染后第6天检出。本研究开发了一种口腔液中ASF sIgA抗体的现场即时检验(point-of-care testing,POCT)量子点免疫试纸条,为ASFV的监测和防控提供了新的技术支持和补充。

啶虫脒金标免疫速测试纸条研制及其在茶叶中的应用

阐述了一种基于直接竞争免疫层析法的啶虫脒金标速测试纸条的研制方法,及其在茶叶中快速检测与诊断啶虫脒残留的应用情况。通过制备啶虫脒人工抗原,获得了高灵敏度的单克隆抗体,抗体效价大于1:10 000。据此研制的金标速测试纸条对啶虫脒肉眼判断的检出限为10 ng/m L,检测时间为10 min;可特异性地检测茶叶(绿茶、红茶、铁观音)中烟碱类农药啶虫脒的残留量,而对其他烟碱类农药(吡虫啉、噻虫嗪、烯啶虫胺等)无交叉反应,能满足中国茶叶中啶虫脒最大残留限量(0.5 mg/kg)下的检测要求,具有灵敏度高、使用便捷、结果准确、成本低等优点。该技术可以实现成品茶样品中啶虫脒的现场快速测试诊断。

动物源食品中氯霉素残留速测金标试纸条的研制

应用杂交瘤技术制备了抗氯霉素单克隆抗体,并根据竞争式胶体金免疫层析试验原理,研制了氯霉素检测免疫试纸条。研究结果表明,该单克隆抗体对氯霉素的亲合性好,特异性高;该金标试纸条适用于动物源食品中氯霉素残留的快速检测,对虾肉、蜂蜜样品的最低检出限为1.5μg/kg,对鲜奶的最低检出限为3μg/kg,检测时间只需5～8min。

免疫凝聚试纸条和TaqMan探针实时荧光PCR检测西瓜细菌性果斑病菌比较研究

以西瓜细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp．citrulli）菌悬液和田间采集的病组织为试材，研究了免疫凝聚试纸条和实时荧光PCR技术检测的灵敏度和适应性。结果表明，免疫凝聚试纸条检测灵敏度为10^6 cfu／mL，具有简便、快速、易操作特点，适用于田间快速检测和病害诊断；TaqMan探针实时荧光PCR检测灵敏度达10^3～4 cfu／mL，比传统PCR检测灵敏度（10^5 cfu／mL）提高了10～100倍，且不需要琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色和Southern杂交。但需要昂贵的仪器和试剂，适用于室内检测及相关研究。

免疫检测试纸条法检测西瓜子中的瓜类果斑病菌

将西瓜子进行表面消毒后破碎,用无菌水于4℃浸泡4h,取300μL浸提液加入250mL细菌液体培养基中,28℃150r/min培养3d,取培养液0.7mL与Agdia公司提供的瓜类果斑病菌检测试纸条样品浸提网袋中的缓冲液混匀,取混合液1mL用于免疫检测试纸条检测。该方法可有效检测出西瓜子中是否带有瓜类果斑病菌(Acidovorax avenaesub sp.citrulli(Schaadet al.)Willems et al.)。

番茄细菌性溃疡病苗期接种新方法的研究

在剪叶、浸根和针刺等细菌病害传统接种方法基础上设计了打顶接种新方法;以番茄细菌性溃疡病菌中国菌株和美国菌株借助打顶法接种佳粉10、合作908和华南红宝石3个国内主栽番茄品种2～3片真叶期幼苗,在昼夜最低、最高温度15～18℃、32～35℃和相对湿度为30%～60%的温室条件下,打顶法接种番茄幼苗后溃疡病发病率为87.5%～100.0%,病情指数随接种菌悬液浓度提高而增大,达到23.96～82.29,3个供试品种之间表现稳定一致;剪叶、浸根和针刺接种方法的发病率普遍在40%以下,病情指数在20以下,3个供试品种之间未表现明显差异;进一步研究显示,使用选择性培养基mSCM能够从打顶法接种后的发病植株上获得培养性状与原接种体一致的分离物,专化性免疫凝聚试剂盒检测到特定的测试线,PCR扩增到614 bp的特异性条带,证实该分离物为番茄细菌性溃疡病菌,发病植株为接种体侵染所致.该研究结果表明,打顶接种方法比剪叶法、针刺法和浸根法更适合用于番茄溃疡病菌的致病性测定和评价不同番茄品种苗期的抗病性,具有应用价值.

南瓜花叶病毒胶体金免疫层析试纸条的研制

使用柠檬酸三钠还原法制备25nm粒径的胶体金颗粒,在pH7.6,蛋白用量13μg/mL条件下,制备形成稳定胶体金蛋白复合物;使用微定量喷头在硝酸纤维素膜上喷好病毒检测线和质控线,组装制成免疫层析检测试纸条。结果表明经过条件优化后制备的南瓜花叶病毒试纸条特异性好,可在10min内检测出结果,且对南瓜花叶病毒阳性材料的检测灵敏度可达到稀释104倍。

胶体金免疫层析试纸结合RT-PCR法快速检测烟草环斑病毒

利用烟草环斑病毒胶体金免疫层析检测试纸条,对烟草环斑病毒3个分离物进行了快速检测。结果表明,试纸条在10min内,可特异性检出烟草环斑病毒的3个分离物,对番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒、番茄黑环病毒和健康叶片无反应。剪下试纸条上显示的检测带,进行RT-PCR,能扩增到与预期大小相同的DNA条带。试纸条检测烟草环斑病毒粗提纯液,检测灵敏度在1μg·mL-1,试纸条检测烟草环斑病毒的病汁液,检测灵敏度在10-3(W/V),试纸条检测灵敏度与DAS-ELISA方法灵敏度基本相同。

黄瓜绿斑驳花叶病毒磁免疫层析试纸条的研制

用磁性纳米颗粒标记黄瓜绿斑驳花叶病毒的兔多克隆抗体建立了简便快速的磁免疫层析试纸条检测方法。该方法检测提纯病毒的灵敏度为0.1μg/mL,检测葫芦病汁液可稀释10 000倍(重量/体积)。试纸条和黄瓜绿斑驳花叶病毒具有特异性反应,和同属的烟草花叶病毒、番茄花叶病毒、辣椒轻斑驳病毒和齿兰环斑病毒,未出现交叉反应。该试纸条可用于田间病害检测和诊断。

农杆菌介导遗传转化云蔗05-51

【目的】建立云蔗05-51组培再生体系明确其对抗生素G418的耐受性,为云蔗05-51基因工程遗传改良提供参考。【方法】以云蔗05-51心叶为外植体,MS基本培养基添加2,4-D、6-BA和KT,设置质量浓度梯度及不同激素配比,诱导愈伤组织及其分化植株。在云蔗05-51胚性愈伤组织增殖与不定芽分化阶段,培养基中添加不同含量的G418,确定合适的G418筛选质量浓度。以nptⅡ为标记基因,农杆菌介导遗传转化云蔗05-51胚性愈伤组织,筛选获得抗性植株,PCR和NPTⅡImmunoStrip检测确定nptⅡ基因的整合与表达。【结果】云蔗05-51愈伤组织诱导与增殖阶段,适宜的培养基配方为MS基本培养基添加3.0 mg/L 2,4-D;愈伤组织分化不定芽阶段宜采用MS基本培养基添加1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT。云蔗05-51对G418耐受性筛选结果显示:愈伤组织增殖阶段和分化不定芽阶段G418的适宜筛选质量浓度分别为40和20 mg/L。G418抗性植株PCR检验表明:标记基因nptⅡ已成功整合到云蔗05-51转基因植株基因组中;NPTⅡImmunoStrip检测表明:nptⅡ的蛋白水平得以表达。【结论】建立了云蔗05-51心叶组培再生体系,明确了40和20 mg/L G418是筛选抗性愈伤和抗性植株的适宜质量浓度。建立了农杆菌介导遗传转化云蔗05-51胚性愈伤组织系统,为有益基因导入甘蔗品种提供了参考。

番茄环斑病毒和烟草环斑病毒复合型胶体金免疫层析试纸条的研制

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记番茄环斑病毒和烟草环斑病毒的兔多克隆抗体,用微定量喷头在硝酸纤维素膜上喷好2条病毒检测线(T线)和1条羊抗兔抗体质控线(C线),制成复合型免疫层析检测试纸条。一张试纸条在10min内,可同时检测出这两种病毒。试纸条检测番茄环斑病毒和烟草环斑病毒粗提纯液,检测灵敏度在1μg/mL,试纸条检测番茄环斑病毒和烟草环斑病毒的混合病汁液可稀释1000倍(重量/体积)。用健康叶片和缓冲液对照测试,试纸条结果都为阴性。

莴苣花叶病毒胶体金免疫层析试纸条的研制

为建立莴苣花叶病毒的现场快速检测方法,采用胶体金标记莴苣花叶病毒的兔多克隆抗体,在硝酸纤维素膜上喷涂检测T线和质控C线,制作胶体金免疫层析试纸条。该试纸条检测莴苣花叶病毒提纯病毒的灵敏度为1μg·mL-1,检测昆诺阿藜病汁液可稀释1 000倍(重量/体积)。试纸条可特异性检测到莴苣花叶病毒的3个分离物,与马铃薯X等8种病毒无交叉反应。田间采集的莴苣样品试纸条和酶联检测的结果一致。该试纸条适用于疑似莴苣花叶病毒感染的莴苣叶片的快速诊断,并在10min内获得检测结果。

大豆种传南方菜豆花叶病毒和烟草环斑病毒的GICA-RT-PCR检测

南方菜豆花叶病毒(south bean mosaic virus,SBMV)和烟草环斑病毒(tobacco ringspot virus,TRSV)是我国重要的进境检疫性有害生物,两种病毒均为种传病毒,可随大豆种子实现远距离传播。本研究以这两种病毒的大豆病种子为试材,先用胶体金免疫层析试纸条(GICA)检测,将检测完病毒后的胶体金免疫层析试纸条上的T线和C线剪下,再用RT-PCR的方法将T线和C线上捕获的病毒直接进行扩增,这种将血清学与分子生物学相结合起来所建立的GICA-RT-PCR检测方法,省去了烦琐的总RNA提取的环节,简化了病毒检测的步骤,提高了检测的灵敏度。

上转换发光免疫层析法快速检测牛奶中雌二醇

建立定量快速检测雌二醇(E2)的上转换免疫层析技术。以上转换发光材料(UCP)为新型标记物,采用戊二醛法偶联单克隆抗体(m Ab),制备UPT-m Ab复合物,并以其作为探针,基于小分子竞争结合,建立免疫层析试纸条方法,并对试纸条性能进行评价。方法特异性强,稳定性好,灵敏度高,最低检出限低至2.75 ng/m L,线性范围为5 ng/m L^2 000 ng/m L,回收率88.88%~103.5%,变异系数CV<10%。成功构建了上转换免疫层析法用于检测雌二醇,适用于现场快速检测,具有良好的经济价值和应用前景。

GICA-RT-PCR检测菜豆荚斑驳病毒的新方法

菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)是我国进境植物检疫性有害生物。为解决普通RT-PCR不能直接检测大豆病种子中该病毒的问题,将简便快速的胶体金免疫层析技术(GICA)和高灵敏度的普通RT-PCR检测技术有机地结合起来,建立了GICA-RT-PCR检测新方法。即先用GICA捕获病毒,将捕获的病毒直接进行RT-PCR扩增,简化了检测的步骤,提高了检测的灵敏度。结果表明:用该方法检测提纯病毒灵敏度达到0.01μg.mL-1、检测大豆病叶和病大豆种皮,灵敏度达到10-4,分别比GICA检测提高了20倍、10倍和100倍。GICA-RT-PCR可进一步确认GICA的结果。

莴苣丛枝植原体胶体金免疫层析试纸条的初步研制

采用柠檬酸三钠还原法制备25 nm粒径胶体金颗粒,在pH 8.5的条件下与21μg/m L兔抗莴苣丛枝植原体(Le WB)免疫膜蛋白(Imp)多克隆抗体形成稳定的胶体金蛋白复合物,将兔抗莴苣丛枝植原体免疫膜蛋白IgG与羊抗兔IgG分别点在硝酸纤维素膜上作为检测线(T)和质控线(C),组装成胶体金免疫层析试纸条。结果表明:该试纸条除可以检测莴苣丛枝植原体外,还能检测与其具有相同免疫膜蛋白特性且隶属16SrⅡ-A亚组的其他植原体株系,如菊苣丛枝植原体(Ch WB)、扁豆花变绿植原体(Le VP)、蕹菜丛枝植原体(WSWB)、银胶菊花变绿植原体(Pa VP)等。试纸条可特异检测16SrⅡ-A亚组植原体株系,对莴苣丛枝植原体阳性材料的检测灵敏度为稀释100倍。

免疫试纸条结合RT-PCR法快速检测马铃薯Y病毒

利用马铃薯Y病毒(PVY)免疫试纸条,对PVY进行了快速检测,结果表明,试纸在2 min内,可特异性检出PVY,而健康的叶片无反应。刮下试纸条上显示的检测带,进行RT-PCR,能扩增到与预期大小相同的DNA条带,是对快速检测试纸条检测结果的验证。

4种葫芦科植物病毒复合胶体金免疫层析试纸条的研制

使用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,在pH值7.6,蛋白用量10～15μg/mL条件下,制备形成4种葫芦科植物病毒多克隆抗体的稳定胶体金蛋白复合物;设计了双向复合试纸条,使用微定量喷头在试纸条两侧的硝酸纤维素膜上分别喷2条病毒检测线和1条质控线,组装制成免疫层析检测试纸条。结果表明经过条件优化后制备的双向复合试纸条特异性好,可在10min内同时检测4种葫芦科植物病毒,且对不同病毒阳性材料的检测灵敏度可达到稀释103倍以上。

烟草环斑病毒磁免疫层析试纸条的研制

烟草环斑病毒是我国检疫性有害生物,为防止该病毒传入国内,需建立快速的诊断和检测方法。将烟草环斑病毒的多克隆抗体吸附到磁性纳米颗粒上,研制出磁免疫层析检测试纸条。该试纸条可特异性检测烟草环斑病毒,检测部分提纯病毒的灵敏度为1μg/mL,检测烟草病汁液可稀释1000倍(重量/体积)。该试纸条和线虫传多面体病毒属的番茄环斑病毒、番茄黑环病毒、南芥菜花叶病毒和葡萄扇叶病毒未出现交叉反应,可用于烟草环斑病毒的现场检测。