非洲猪瘟病毒P54蛋白原核表达及间接ELISA检测方法建立

【目的】建立一种具有良好特异性和敏感性的非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)抗体间接ELISA检测方法。【方法】根据ASFV P54蛋白基因序列进行大肠杆菌密码子优化,将优化后的P54序列克隆到pET-28a(+)质粒中,构建重组质粒pET28a-P54,利用大肠杆菌表达系统表达目的蛋白并用His镍柱进行纯化,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,以纯化的P54蛋白作为检测抗原进行包被,建立一种间接ELISA方法,对包被条件、封闭液、封闭时间和血清孵育等反应条件进行优化后,对其临界值、特异性、灵敏性和重复性进行验证。【结果】SDS-PAGE结果显示,P54蛋白分子质量为42 ku,纯度在95%以上;Western blotting结果显示,P54蛋白与ASFV阳性血清能产生特异性反应。优化后的ELISA反应条件为:0.3125μg/mL抗原37℃包被1 h,5%脱脂奶粉37℃封闭1 h,1∶800稀释的血清37℃孵育2 h,1∶15000稀释的酶标二抗37℃孵育1 h。该ELISA检测方法仅与ASFV阳性血清产生特异性反应,与猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、牛病毒性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒和乙型脑炎病毒的阳性血清均无明显交叉反应;该方法灵敏性较高,ASFV阳性血清稀释度为1∶3200时仍有明显反应。批间重复和批内重复变异系数均<10%;与商品化试剂盒相比,其阳性符合率为95.45%,阴性符合率为96.05%,总符合率为95.83%。【结论】本研究建立了一种以ASFV P54蛋白为检测抗原的ASFV间接ELISA方法,该方法具有良好的特异性和敏感性,能运用于ASFV的血清学检测,为非洲猪瘟的快速诊断提供更多选择。

基于重组核衣壳蛋白的猪德尔塔冠状病毒间接ELISA检测方法的建立

目的:建立一种关于猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus, PDCoV)抗体的检测方法。方法:对猪德尔塔冠状病毒的核衣壳蛋白(N)进行原核表达,通过Western Blot、SDS-PAGE等方法,对重组蛋白进行鉴定;在获得正确表达的重组蛋白后,以此为抗原,对ELISA反应条件进行优化,并对其特异性、敏感性、重复性进行测试,最终建立ELISA检测方法,并对临床样品进行检测。结果:优化后的抗原包被浓度为2μg/孔,37℃孵育1 h;1%BSA 37℃封闭1 h;一抗稀释最佳浓度为1∶1 600,孵育时间为1 h;酶标二抗最佳孵育时间为60 min。重组蛋白能与猪德尔塔冠状病毒血清发生特异性反应,所建立的检测方法具有优良的敏感性、特异性、重复性。结论:本研究建立了一种针对猪德尔塔冠状病毒的间接ELISA检测方法,为猪德尔塔冠状病毒的抗体水平检测及疾病的防控提供了一种有效的方法。

狐源兔脑炎微孢子虫极管蛋白2(PTP2)的原核表达及间接ELISA方法的建立

为了建立一种特异性好、敏感性高、重复性好的可检测蓝狐兔脑炎微孢子虫病的间接ELISA方法,试验首先从疑似感染兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon.cuniculi)的蓝狐脑组织DNA中扩增PTP2基因,并将其与原核表达载体pET-32a(+)连接,构建重组质粒pET32a-PTP2,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,将菌体超声后对表达的重组蛋白进行可溶性分析,并纯化目的蛋白;然后以重组蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件和临界值的确定建立蓝狐兔脑炎微孢子虫的间接ELISA方法,并进行特异性、敏感性和重复性试验;最后采用建立的间接ELISA方法对28份经常规PCR方法验证已经感染兔脑炎微孢子虫病的蓝狐血清样品进行检测,并计算符合率。结果表明:表达的重组蛋白的分子质量为45.8 ku,且表达产物以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,经纯化杂带明显减少,纯化后的重组蛋白质量浓度为1.55 mg/mL。间接ELISA方法的最佳包被抗原质量浓度为8μg/ml,最佳一抗稀释度为1∶100,最佳封闭液为5%脱脂乳,最佳封闭条件为37℃、1 h,最佳一抗孵育时间为120 min,最佳二抗稀释度为1∶5 000,最佳二抗孵育时间为60 min,最佳显色时间为20 min。阴、阳性血清OD_(450)临界值分别为0.268和0.302。建立的间接ELISA方法检测蓝狐犬瘟热病毒、蓝狐伪狂犬病毒、蓝狐细小病毒阳性血清均为阴性,可检测到稀释度为1∶3 200的蓝狐兔脑炎微孢子虫阳性血清,批内重复与批间重复变异系数均小于10%。用建立的间接ELISA方法检测28份蓝狐血清样品的阳性样品数为23份,与常规PCR方法的符合率为82.14%。说明试验成功建立了一种可检测蓝狐兔脑炎微孢子虫病的间接ELISA方法,该方法特异性好、敏感性高、重复性好,适合在基层推广。

A型塞内卡病毒抗体ELISA检测方法的建立与应用

为建立基于VP2蛋白、VP3蛋白检测猪塞内卡病毒A(SVA)抗体血清学方法。本研究扩增SVA VP2基因和VP3基因(VP23基因),基因全长1569 bp,并与原核表达载体pGEX-6p-1构建重组载体,IPTG诱导表达可溶性rVP23蛋白,经蛋白酶切除标签蛋白得到sVP23蛋白,分子量约为58 kDa。通过矩阵优化、确定临界值、敏感性分析、特异性鉴定,建立了SVA抗体间接ELISA方法。该方法的S/P临界值标准为0.35,批内批间变异系数均小于7%,与中和试验结果符合率为95.49%。上述结果表明,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于塞内卡病毒血清抗体检测和流行病学调查。

旋毛虫海藻糖酶(TsTRE)蛋白的表达及其间接ELISA抗体检测方法的建立

目的 以原核表达的旋毛虫海藻糖酶(Trichinella spiralis trehalase, TsTRE)重组蛋白作为检测抗原,建立间接ELISA抗体检测方法。方法 本实验采用RT-PCR技术扩增TsTRE基因,将其与pCold I表达质粒连接并于E.coli BL21感受态细胞中表达。应用亲和柱层析技术获得纯化rTsTRE,分别利用间接免疫荧光技术和Western-blot技术定位TsTRE和检测rTsTRE的免疫反应原性。与此同时,以rTsTRE蛋白为包被抗原建立间接ELISA抗体检测方法,并对其抗原包被浓度和待测血清稀释度、抗原包被条件、封闭液种类和封闭条件、酶标二抗稀释度和孵育条件、TMB显色时间等进行优化。确定该方法的临界值及评估该方法的重复性、敏感性、特异性和临床检出率等性能。结果 免疫荧光结果显示,在肌幼虫的杆状体、尾部和表皮等部位含有大量的海藻糖酶;Western-blot结果显示,rTsTRE可结合感染旋毛虫42 d小鼠的阳性血清且蛋白分子量约为60 kDa。建立的间接ELISA抗体检测方法的阳性临界值为0.384;批内和批间变异系数分别在5.504%~7.630%和4.664%~9.929%,且均不超过10%;最低检出效价为1∶1 280;与华支睾吸虫、血吸虫、猪蛔虫、猪弓形虫和弓首蛔虫抗体均无交叉反应,特异性较强;临床阴性检出率为0%。结论 本实验成功表达rTsTRE,以该蛋白为包被抗原建立的间接ELISA检测方法具有良好的重复性、敏感性、特异性和临床检测性,可应用于临床样本的检测。

猪流行性腹泻病毒感染小鼠血清抗体间接ELISA方法的建立

为建立检测感染小鼠血清中猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体的方法,本研究应用PEDV受体结合区(receptor binding domain, RBD)重组蛋白作为抗原,通过探索各反应的最佳条件,并进行了该方法灵敏度、重复性、特异性分析。结果显示,最佳蛋白包被浓度为5μg/mL,待检血清稀释浓度为1∶400,孵育时间为37℃30 min,羊抗鼠IgG-HRP作为二抗,孵育条件为37℃30 min,底物显色时间为15 min。对建立的ELISA检测方法进行验证,阳性对照血清的稀释度为1∶204 800倍时OD450值仍大于临界值,批内和批间的变异系数均小于10%,对猪传染性胃肠炎病毒和猪δ冠状病毒抗体小鼠阳性血清检测均不发生交叉反应。结果表明本研究建立的小鼠血清PEDV抗体间接ELISA方法具有很好的灵敏度、重复性、特异性。为PEDV候选疫苗的小鼠血清特异性抗体检测提供了一种精准、高效的方法。

坦布苏病毒NS1蛋白的表达及ELISA检测方法的建立

为了建立坦布苏病毒(TMUV)感染鸭群的抗体检测方法,以TMUV NS1的原核表达蛋白质作为包被抗原,建立了间接ELISA方法,并对该方法进行了检测条件的优化。将TMUV NS1全基因序列克隆至pET-28a(+),利用BL21(DE3)表达NS1蛋白,纯化后其质量浓度为4.16μg·μL^(-1)。通过方阵试验,确定了NS1蛋白的最佳包被质量浓度是100ng·孔-1,检测血清的最佳稀释倍数为40倍。随后对检测条件进行了优化,优化后的结果:抗原的最佳包被条件是4℃作用过夜;酶标二抗的最佳工作条件是稀释5 000倍,37℃作用1h;阴阳血清的临界值为0.278。一系列试验验证了该检测方法具有很强的特异性、敏感性、重复性。对采集自山东各地的80份血清样品进行检测,其检测结果显示,该方法与经典的鸡胚中和试验检测结果的符合率为93.5%以上,且比传统的中和试验更敏感。对TMUV感染鸭群的血清进行检测,描述了TMUV感染后鸭群抗体水平的消长规律,为该病的防治提供重要的理论依据。以NS1蛋白为包被抗原的间接ELISA方法的建立为临床上TMUV的感染提供了一种新的抗体检测方法,尤其是在TMUV早期感染的检测方面有着更为广泛的应用前景。

鱼肠道弧菌间接ELISA快速检测法的建立

为准确、快速诊断鱼肠道弧菌感染所致的海水鱼类全身性败血症,以鱼肠道弧菌为抗原,制备抗鱼肠道弧菌多克隆抗体,建立了鱼肠道弧菌间接酶联免疫吸附检测方法。该方法最佳反应条件为:抗原包被密度为107 cfu/mL,免疫血清稀释度为1∶211。病原菌检测灵敏度为每孔105 cfu/mL。抗血清与迟缓爱德华氏菌、杀鲑气单胞菌、恶臭假单胞菌、鱼肠道弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、溶藻胶弧菌、秦皇岛弧菌8种水产致病菌的交叉反应结果呈阴性。用该法检测人工感染后的牙鲆和健康牙鲆,在发病鱼的肝脏、肾脏、脾脏、腹水等处检测出病原菌而健康鱼则为阴性。该技术能够准确、快速检测出鱼肠道弧菌。

间接竞争ELISA检测大豆11S球蛋白和7S伴球蛋白

采用酸沉淀、亲和层析(ConA-Sepharose 4B)等手段,成功地分离纯化了大豆11S球蛋白和7S伴球蛋白,SDS-PAGE检测表明2种蛋白纯度分别达到95%和90%。将纯化的11S球蛋白和7S伴球蛋白分别免疫大白兔获得抗血清,并建立起间接竞争ELISA检测大豆豆粕及其深加工产品中11S和7S抗原蛋白含量的方法。

胸腺素α1间接ELISA测定方法的建立及其在转基因蓝藻中的应用

利用胸腺素α1(Tα1)_小牛血清白蛋白融合蛋白免疫新西兰兔获得的抗体 ,建立了Tα1间接酶联免疫吸附测定法 (ELISA) ,以定量检测转Tα1基因聚球藻7942外源基因表达产物胸腺素α1 ,实验结果表明该方法灵敏度高、专一性强、重复性好 ,可用于转基因微藻Tα1表达量的定量检测 ,同时表明Tα1基因能在聚球藻7942中稳定表达。

甘蔗宿根矮化病的I-ELISA快速检测

利用从澳大利亚引进的RSD标准抗原抗体,研究建立了I-ELISA检测甘蔗宿根矮化病(RSD)的方法。通过对田间采集的样本进行检测,同时以电镜负染检测法印证,检测结果一致,表明I-ELISA能简便、快速、准确、有效地检测出RSD,为甘蔗宿根矮化病的诊断和防治、脱毒种苗的生产、对外甘蔗品种/材料交换检疫检测提供了技术支撑。

检测猪肺炎支原体抗体间接ELISA方法的建立

选用猪肺炎支原体Mhp J株培养物制备抗原,建立检测猪肺炎支原体抗体的间接ELISA(酶联免疫吸附)方法。结果显示,ELISA试验的最佳反应条件为:抗原包被浓度为1.5μg/ml,待检血清的最佳稀释浓度1∶100,2%明胶作封闭液,抗原抗体最佳结合时间为90 min,酶标抗体1∶10 000(体积比)稀释,最佳作用时间为60 min。对136份样品检测结果表明,建立的猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测方法与美国IDEXX公司生产的猪肺炎支原体抗体检测试剂盒检测的符合率达到83.8%,假阴性率8.8%,假阳性率1.5%。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7脂多糖抗原的提取鉴定及间接ELISA法的建立

目的提取并纯化具有强免疫反应性和高特异性的肠出血性大肠杆菌O157∶H7(E.coliO157∶H7)脂多糖(LPS)抗原,并研究其在E.coliO157∶H7 LPS抗体检测中的应用。方法应用热酚水法提取E.coliO157∶H7 LPS抗原,同时收集水相和酚相LPS,并对其产率、纯度及免疫反应性进行分析比较,用酸解法制备O-特异性多糖(O-SP),并以不同的LPS为包被抗原,建立间接ELISA法检测E.coliO157∶H7 LPS抗体。结果大分子量的E.coliO157∶H7 LPS优先溶于酚相,而水相中含有更多的小分子量LPS,与水相LPS相比酚相LPS具有更高的免疫反应性和纯度,酚相LPS经酸解去脂得到的O-SP具有更高的反应特异性。结论酚相LPS和O-SP都可用于E.coliO157∶H7 LPS抗体的ELISA检测,O-SP具有更高的特异性,是检测E.coliO157∶H7 LPS特异性抗体的理想材料。

环丙沙星完全抗原的制备和间接竞争ELISA检测方法的初步研究

为了研究检测环丙沙星（CIP）残留的间接竞争ELISA方法，试验采用1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺盐酸盐（EDC）一步法将环丙沙星分别与牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清白蛋白（OVA）偶联制备免疫原（CIP—BSA）和包被原（CIP—OVA），用免疫原免疫Balb／c小鼠制备血清多克隆抗体（CIPpAb），并对其血清抗体效价、灵敏度、半数抑制浓度（IC50）、特异性等进行测定。结果表明：血清抗体的效价为1：25600，间接竞争ELISA的线性检测范围为O．54～500ng／mL，灵敏度为0．54ng／mL，IC50为8．13ng／mL，与恩诺沙星的交叉反应率（CR）为100％，与达氟沙星的交叉反应率为50％，与其他化合物的交叉反应率均小于0．8％。说明这种研究方法可以同时检测食品中的环丙沙星和恩诺沙星残留。

新型鸭细小病毒重组VP2蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

为了建立新型鸭细小病毒(novel duck Parvovirus, NDPV)感染鸭群的抗体检测方法,试验采用PCR方法扩增新型鸭细小病毒的VP2基因,将其克隆至pET-32a(+)载体中,获得重组质粒pET-32a(+)-VP2;将该重组质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,经优化诱导表达后通过SDS-PAGE电泳分析表达产物,并对表达的蛋白质进行纯化、复性;再利用阳性血清对表达的蛋白质进行Western-blot鉴定;以纯化的重组蛋白作为抗原包被ELISA酶标板,通过优化抗原包被量、一抗稀释度、抗原封闭条件、一抗和二抗的孵育条件等最终建立间接ELISA方法,并对该方法进行评定。结果表明:成功构建出NDPV重组VP2蛋白,在37℃、1.0 mmol/L IPTG条件下诱导5 h的表达量最大,蛋白质的分子质量约为49 ku,主要以不溶性的包涵体形式存在。纯化、复性后的重组VP2蛋白浓度为2.378 mg/mL,纯度为97%。Western-blot鉴定得到的条带单一,大小为49 ku。间接ELISA检测方法的最佳抗原包被量为200 ng/孔,一抗稀释度为1∶200;其他检测条件最优结果为4℃包被过夜,37℃封闭2 h,一抗37℃孵育1 h,二抗稀释10 000倍,二抗37℃孵育1 h。间接ELISA检测方法的检测临界值为0.445,该方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,对临床样品的阳性检出率为93.3%。说明以重组VP2蛋白为包被抗原建立的间接ELISA检测方法效果良好,为临床NDPV的感染提供了一种新的检测方法。

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立

在最佳条件下,通过对重组质粒pGEX-6P-N进行诱导表达,并利用Glutathione Sepharose 4B亲和吸附柱对表达产物(重组N蛋白)进行纯化。用重组N蛋白作为包被抗原,通过对相关条件进行优化(如抗原包被量,血清稀释度,酶标二抗最佳工作浓度,底物作用时间等),确定判定标准,最终初步建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。用建立的间接ELISA方法检测360份血清样品,并与IDEXX公司研制的ELISA试剂盒检测的结果相比较,批内重复性试验变异系数均值为1.52%,批间变异系数为6.17%,符合率达92.5%,试验表明,建立的间接ELISA检测方法具有良好的重复性和特异性,可用于PRRSV血清抗体的检测。

犬DEA1.1血型抗体间接ELISA检测方法的建立

为探求减少宠物临床中犬因血型错配发生的输血反应,本试验以DEA1.1阳性红细胞膜作为抗原建立能检测DEA1.1抗体的间接ELISA方法。试验以犬DEA1.1血型为主要研究对象,提取犬红细胞膜,以DEA1.1阳性红细胞膜作为抗原,用醛化技术包被抗原,优化间接ELISA反应条件。结果显示,最佳固定剂为浓度0.0625%和0.125%的戊二醛,最佳抗原包被量为4~8μg/孔,最佳封闭液为5%的脱脂奶粉,最佳温度为37℃,最适反应时间为90 min。与间接抗球蛋白试验相比,优化后的间接ELISA法有更高的灵敏性,本试验建立的间接ELISA方法可以对犬DEA1.1血型抗体进行高通量检测。

罗非鱼无乳链球菌间接ELISA检测方法的建立

本文利用终浓度为0.5%(v/v)的甲醛在4℃条件下灭活24 h制备灭活的罗非鱼无乳链球菌,用其作为抗原对兔进行免疫制备兔抗无乳链球菌血清,以无乳链球菌抗兔血清作为一抗,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔Ig G作为酶标二抗,建立并优化了无乳链球菌的间接ELISA快速检测方法。此检测方法的抗原最适包被浓度为1×10~7 CFU/mL,一抗最适工作浓度为1∶100(v/v),二抗最适工作浓度为1∶2 000(v/v),最低检测限为1×10~4 CFU/mL。利用此法对发病的罗非鱼进行检测,阳性检出率为80%,与本试验选取的指示菌株均无交叉反应。

尿液中前列腺小体外泄蛋白检测两种ELISA方法的比较

目的:比较两种尿液中前列腺小体外泄蛋白(PSEP)ELISA检测方法。方法:收集100例ⅢA型前列腺炎患者和100例正常人尿液标本,采用ELISA双抗夹心法和间接法进行检测;同时用稀释液基质(0.1 mol/L PBS缓冲液)标曲系统和尿液基质标曲系统测试30例临床尿液标本,验证标准品与待测标本在不同基质情况下的一致性。结果:ELISA双抗夹心法和间接法两种检测方法,其灵敏度分别为89%和87%,特异度分别是91%和90%,总符合率分别为90%和88.5%,两者无统计学差异。以稀释液基质标曲系统和尿液基质标曲系统测试的结果散点图显示,R^2=0.999,具有良好的线性,稀释液基质与临床尿液样本没有明显的基质差异,互换性良好。结论:根据PESP其自身特性,PSEP检测试剂盒ELISA间接法用于临床检测前列腺炎患者尿液标本切实可行。

应用ELISA间接法检测乙肝核心抗体

作者应用高纯度基因重组的酵母菌生产的 HBcAg(YrHBcAg),建立了 ELISA 间接法。用酶标记抗人 Ig 检测结合于固相 YrHBcAg 上的抗-HBC。检测阳性血清的敏感性比竞争性抑制法高3个滴度;在36份参比血清的检测中,间接法和竞争性抑制法与 Abbott 试剂的符合率分别为72.1%和33.3%;在558份献血员血清的检测中,间接法比竞争性抑制法的检出率高7.7%。