Application of an indirect immunofluorescent staining method for detection of Salmonella enteritidis in paraffin slices and antigen location in infected duck tissues

AIM： To detect Salmonella enteritidis （S. enteritidis） in paraffin slices and antigen location in infected duck tissues. METHODS： The rabbits were immunized with purified bacillus to obtain S. enteritidis-specific antibody, which were then extracted by the caprylic-ammonium sulphate method, purified through High-Q columns. An indirect immuno-fluorescent staining method （IFA） was established to detect the S. enteritidis antigen in paraffin slices. Detected S. enteritidis in each organ tissue of ducklings experimentally infected with S. enteritidis. RESULTS： The gland of Garder, heart, kidney, spleen, liver, brain, ileum, jejunum, bursa of Fabricius from S. enteritidis experimentally infected ducklings were positive or strongly positive, and the S. enteritidis antigen mainly distributed in the infected cell cytoplasm.CONCLUSION： IFA is an intuitionist, sensitive and specific method in detecting S. enteritidis antigen in paraffin wax slices, and it is a good method in diagnosis and antigen location of S. enteritidis. We also conclude that the gland of Garder, heart, kidney, spleen, liver, ileum, jejunum are target organs in S. enteritidis infections of duck, and S. enteritidis is an intracellular parasitic bacterium.

用间接免疫荧光染色法检测鸭病毒性肠炎病毒在人工感染鸭体内的侵染过程和分布规律

用鸭病毒性肠炎病毒(DEV)CHv强毒株感染成年鸭复制鸭病毒性肠炎急性病例,分别于接种后不同时间,取心、肝、脾、肺、肾、胸腺、食道、十二指肠、胰腺、法氏囊和脑组织,制作切片,应用间接免疫荧光染色法(IFA)检测DEV在鸭体内的侵染过程和分布规律。结果显示:感染后4 h可在脾脏、胸腺和法氏囊中检测到DEV抗原;感染后6 h可在肝脏、食道、十二指肠、直肠及肺脏检测到DEV抗原;IFA对各组织器官中DEV的平均检出率为肝脏46/50、脾脏48/50、肺脏46/50、肾脏0/50、肠道46/50、法氏囊46/50、胸腺47/50、胰腺0/50、大脑0/50、食道44/50、心脏0/50。研究表明:在急性病例中,脾脏、法氏囊、胸腺、食道、肠道、肝脏和肺脏为DEV的主要靶器官;接种后,病毒首先在脾脏、胸腺、法氏囊中出现,然后病毒迅速传播到肝脏、消化道和肺脏中;IFA检测石蜡切片中DEV的方法具有直观、特异性强的优点,是对DEV进行检测和抗原定位的较好方法。

利用间接免疫荧光染色和协同凝集技术检测梨火疫病菌

提取梨火疫病菌 (0 0 5 6菌株 )的脂多糖免疫家兔 ,获得抗血清 ,建立了检测梨火疫病菌的间接免疫荧光染色和协同凝集检测技术 ,对梨火疫病菌的不同菌株和人工接种发病样品实施了检测。结果表明 ,这 2种方法可以准确、灵敏地检测梨火疫病菌及样品 ,方法简单、快速、实用 ,可以在中国口岸推广使用 ,减少梨火疫病进入中国的风险。

乳腺癌Ki-67及PCNA表达的比较研究

目的 研究Ki 6 7与PCNA两种增殖抗原在乳腺癌组织中的原位表达特点以及二者的差异性问题。方法 采用间接免疫荧光双标法对 30例乳腺癌组织切片进行Ki 6 7及PCNA染色 ,运用激光扫描共聚焦显微镜观察 ,分析细胞核的荧光阳性面积 ,并对二者进行相关性分析。结果 PCNA的核阳性面积明显大于Ki 6 7,二者的阳性面积呈正相关。结论 在乳腺癌组织中 ,PCNA抗原表达较强 ,几乎涵盖了所有Ki 6 7的增殖信息。

胶质细胞成熟因子支持原代培养的小脑皮质神经元的生存

胶质细胞成熟因子(GMF)是从成年牛脑中提取的一种酸性蛋白质,它能可逆地促进成星形胶质细胞形态和化学的分化。我们现在建立富含神经元的生后7天大鼠小脑皮质分离细胞原代培养物,间接免疫荧光染色分类计数证明,该原代培养物中神经元占细胞总数的97%,其中绝大部分是颗粒细胞。加纯化的 GMF 在此培养物,可明显促进神经元的生存;而不加 GMF 的对照培养物,神经元的数目明显减少。纯化 GMF 的这种作用与其剂量有关,最适的刺激剂量浓度为250 ng/ml。虽然对 GMF 影响小脑皮质神经元生存的机制尚不清楚,但实验结果提示,GMF 的功能不只限于对胶质细胞,它在中枢神经系统内,也可能是一种对神经元起神经营养作用的生长因子。

间接免疫荧光染色检测石蜡切片中的鸭病毒性肠炎病毒和抗原定位

差速离心和蔗糖密度梯度离心纯化鸭病毒性肠炎病毒(DEV)免疫兔制备兔抗DEV高免血清后,用DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化的兔抗DEVIgG建立了间接免疫荧光染色法(IFA)检测石蜡切片中DEV的方法。IFA的最佳条件为:石蜡切片用10mmol/L pH6.0的柠檬酸缓冲液为微波修复液微波修复10min,胰酶修复20min;10%小牛血清室温封闭30min;加入1∶25的兔抗DEVIgG于4℃孵育过夜;再加入FITC标记的羊抗兔IgG于37℃孵育45min。以建立的IFA对DEV人工皮下感染死亡鸭的各组织器官进行检测,在死亡鸭的脾脏、胸腺、法氏囊、肝脏、食道、十二指肠、直肠及肺脏中检测到DEV抗原。研究表明,IFA检测石蜡切片中的DEV具有直观、特异性强的优点,是对DEV进行检测和抗原定位的良好方法。

甘蔗茎尖细胞有丝分裂过程中微管骨架的变化

利用改进的冰冻切片法结合间接免疫荧光标记技术对甘蔗茎尖细胞有丝分裂过程中微管骨架的变化进行了研究。结果表明,在甘蔗茎尖细胞有丝分裂过程中存在4种循序变化的典型微管列阵,即周质微管、早前期微管带、纺锤体微管及成膜体微管。同时,还观察到在各种典型微管列阵相互转变过程中存在各种微管列阵的过渡状态。甘蔗茎尖正在伸长的幼叶部位细胞的周质微管主要为与细胞伸长轴相垂直的横向周质微管;茎尖幼叶部位伸长缓慢细胞的微管主要为纵向及斜向排列的周质微管,在甘蔗茎尖幼叶基部初生增粗分生组织处,横向、斜向、纵向及随机排列的周质微管列阵均有分布。在少数分裂前期的细胞中,发现细胞具有2条早前期微管带,其具体功能还不清楚。表明甘蔗茎尖细胞微管列阵的变化与许多双子叶植物及部分单子叶植物具有共同的变化规律,进一步证明微管骨架的周期性变化在植物中具有普遍性。

利用PCR和间接免疫荧光染色技术检测风信子黄腐病菌

根据风信子黄腐病菌(Xanthom onas hyacinthi,XHA)的fimA基因,合成了1对特异性引物JAAN/JARA,目的片段为226 bp,用来检测样本中有无目标细菌。用XHA全菌体免疫家兔,获得抗血清,建立了检测风信子黄腐病菌的间接免疫荧光染色检测技术。用上述两种方法对风信子黄腐病菌和人工接种发病样品进行检测。结果表明,这两种方法可以准确、灵敏地检测风信子黄腐病菌及带菌样品,方法简单、快速、实用,可以在口岸检疫中推广使用,以减少风信子黄腐病菌进入中国的风险。

流式细胞术外周血样品间标的方法

目的 建立一种新的用于流式细胞术 (FCM)外周血样品的间标荧光染色方法 .方法 抗凝全血 1 0 0 μL,加入一抗 5 0μL ,室温下反应 30 min,上 Q- PREP型免疫学样品制备仪 ,溶解红细胞和固定标品 ,加入荧光二抗 5 0 μL ,室温下反应 30 min,再加入 5 0 0 μL 的 PBS制成单细胞悬液 ,上流式细胞仪分析 ,同时与其他 5种常规方法进行比较 .结果 本方法与其他 5种方法的 FCM测定结果基本一致 (P>0 .0 5 ) ,而本方法样品用量少 ,操作简单 ,快速、染色时间仅需 70 m in.结论 我们建立的外周血样品间接荧光染色法 (方法 2 ) ,是外周血 FCM样品染色的理想方法 ,该方法对于 FCM在临床检验和基础研究的应用提供了技术支持 ,具有较强的实用价值 .

小球隐孢子虫诱导的小鼠肠粘膜免疫应答

给３周龄昆明小鼠接种小球隐孢子虫（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｐａｒｖｕｍ）卵囊后，在测定其卵囊排出情况的同时，分别用间接ＥＬＩＳＡ和免疫组化染色法对不同时期小肠液中特异性ＩｇＡ及肠粘膜固有层中ＩｇＡ分泌型浆细胞进行定性和定量测定。结果显示，卵囊排出呈间歇型，小肠粘膜固有层中ＩｇＡ分泌型浆细胞消长趋势与小肠液中ＩｇＡ消长趋势相一致，并且它们上升的趋势与卵囊排出下降的趋势相一致，表明在抗隐孢子虫感染中，粘膜免疫起着重要作用。

广州管圆线虫的抗原定位研究

目的 为广州管圆线虫抗原的分离、纯化及广州管圆线虫病的免疫诊断等提供实验依据。 方法 运用间接荧光抗体试验 (IFAT)和免疫金银染色试验 (IGSS)对广州管圆线虫的抗原定位进行研究。 结果 在 IFAT中 ,广州管圆线虫的肠管壁、子宫内虫卵的卵细胞、卵巢和皮层具有特异性荧光 ,提示这些器官具有抗原性。而在 IGSS中 ,广州管圆线虫的抗原定位器官只有肠管壁、子宫内虫卵的卵细胞和卵巢 ,而不包括皮层。 结论 虫体的肠管壁是主要的抗原定位器官 ,虫体子宫内虫卵和卵巢亦显示有抗原性 ,这些器官中的抗原与感染宿主的免疫密切相关。

间接免疫金银染色检测血清抗核抗体

应用间接免疫金银染色(IIGSS)检测了系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病病人及正常人血清中的抗核抗体(ANA),并与间接荧光抗体试验(IFAT)作了比较。在149份血清中IIGSS检出45份阳性,IFAT只检出29份阳性。IFAT有32份为可疑,IIGSS只有2份为可疑。且ANA滴度以IIGSS为高,核型显示以IIGSS更清楚。结果表明,IIGSS检测血清ANA特异性高,较IFAT更敏感、可靠、并能反映ANA组分。

膀胱癌细胞中心体异常与肿瘤预后关系的实验研究

目的通过对膀胱移行细胞癌细胞中心体的研究,了解膀胱移行细胞癌细胞中心体异常的状况,探讨中心体异常在预测膀胱移行细胞癌发生发展过程中的作用及意义。方法从263例膀胱移行细胞癌标本中随机选取60例膀胱移行细胞癌标本进行中心体特性的详细研究,同时选取其中5例膀胱移行细胞癌标本的正常膀胱黏膜上皮作为正常对照。中心体染色采用间接免疫荧光染色方法,一抗为抗中心体周围蛋白单克隆抗体。结果中心体异常与膀胱移行细胞癌的不同的病理分级、肿瘤数目、肿瘤进展及复发性之间差异具有显著性(P<0.05)。结论膀胱移行细胞癌细胞中心体异常与膀胱移行细胞癌发生、发展及复发存在显著相关;检测中心体异常可作为膀胱癌复发的一个预测因子。

局部二维结构描述的HEp-2染色模式分类

Hep-2染色模式分类主要用于免疫疾病诊断,但已有方法受荧光成像环境,细胞图像自身的视觉特性的影响,分类准确率较低.本文提出一种新的适合于HEp-2染色模式分类的特征提取方法.在构建了不同尺度下的高斯平滑图像序列后,利用shape index实现图像二维结构的直观描述,进而通过多灰度阈值图像结构的空间分解,使其同时具备对微观二维图像结构和空间信息的描述能力.该方法在ICPR和SNP HEp-2数据集的两折交叉细胞级测试中,分别获得89.83%和87.49%的准确率,在ICPR的28折交叉细胞级和图像级测试分别达到60.5%和70.56%的准确率,明显优于LBP、CLBP等方法,和CoALBP特征相当.

基于表位多肽的抗TRIM22抗体的制备及其初步应用

目的制备抗TRIM22多肽抗体及鉴定其性能。方法将TRIM22 N端15个氨基酸的多肽(MDFSVKVDIEKEVTC)与钥孔嘁血蓝蛋白(KLH)偶联,免疫新西兰白兔制备抗血清;将TRIM22多肽与Affi-Gel 10偶联制备免疫亲和层析柱,兔抗血清经亲和层析纯化后得到TRIM22多肽特异性抗体;采用ELISA测定抗体效价、Western blot鉴定抗体特异性,并利用该抗体通过间接免疫荧光实验来检测TRIM22蛋白的细胞内定位。结果获得了抗TRIM22特异性抗体。Western blot结果显示该抗体能特异识别真核及原核表达的TRIM22蛋白。利用该抗体进行的间接免疫荧光实验发现TRIM22蛋白主要定位在HepG2细胞核中。结论该抗体的制备为TRIM22分子的功能研究提供了有力的工具。

大鼠肺动脉平滑肌细胞的培养

大鼠肺动脉壁薄，平滑肌细胞数少，经人工继代培养后细胞往往显示与在体内时不同的反应，故用荧光分光光度计检测该处细胞内钙难于实现。共焦激光显微钝可以测试一个细胞内钙浓度的动态变化，要求所测试细胞必须是非收缩细胞，且较牢固地粘附在培养皿上。本法应用０．２％Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ，０．０１２５％Ｅ－ｌａｓｔａｓｅ，０．１２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ分离大鼠肺动脉平滑肛细胞进行原代培养，经间接荧光抗体染色法证明９５％以上为平滑肌细胞。此法培养的细胞可用于共焦激光显微镜测试细胞内Ｃａ（２＋）等浓度的动态变化。

乳腺癌组织中BP1与Bcl-2表达相关性的临床意义

目的:检测Beta protein 1(BP1)在乳腺组织中的表达并探讨其与Bcl-2表达的相关性。方法:运用RT-PCR(reverse transcript-polymerase chain reaction)及Western blot方法检测45例乳腺癌组织和相应癌旁组织中BP1的表达及乳腺癌组织中Bcl-2的表达。间接免疫荧光双标法观察乳腺癌组织中BP1和Bcl-2有无共定位。结果:乳腺组织中,RT-PCR检测癌组织中BP1 mRNA表达量为0.944±0.534,相应癌旁组织中BP1 mRNA表达量为0.115±0.081,两组相比差别有统计学意义(P<0.05);Western blot结果示癌组织中BP1蛋白表达水平为0.949±0.593,相应癌旁组织中为0.095±0.057,两组相比差别有统计学意义(P<0.05)。癌组织BP1表达明显高于癌旁组织。两种检测方法分别从基因和蛋白水平得到一致的结果,癌组织BP1表达均明显高于癌旁组织。乳腺癌组织中BP1与Bcl-2表达的相关性:RT-PCR检测BP1 mRNA的表达量为0.944±0.534,Bcl-2 mRNA的表达量为0.885±0.503(r=0.685,P<0.05);Western blot结果示BP1蛋白表达水平为0.949±0.593,Bcl-2蛋白表达水平为0.644±0.388(r=0.678,P<0.05)。结果表明BP1与Bcl-2的表达存在正相关。间接免疫荧光双标法:激光共聚集显微镜下观察到BP1与Bcl-2共定位于乳腺癌细胞的胞浆中。结论:BP1基因是导致乳腺癌发生的一种癌基因并可能成为乳腺癌中新的治疗靶点。BP1与Bcl-2的表达存在正相关,BP1可能通过上调Bcl-2抑制乳腺癌细胞的凋亡,这可能是其发挥致癌作用机制之一。

胆汁纳米细菌的培养

目的:介绍从胆汁中培养纳米细菌的方法. 方法:无菌抽取30例胆囊结石患者的胆汁经“稀释-离心-过滤”或“过滤法”预处理后,在常规细胞培养条件下进行纳米细菌培养．光镜下观察细菌形态．采用间接免疫荧光染色对培养所得细菌进行鉴定,并在电镜下观察．结果:30例胆汁样本,经过“稀释-离心-过滤”预处理后,纳米细菌培养的阳性率为40％,经“过滤法”预处理后,纳米细菌培养的阳性率为57％,两种方法预处理后,胆汁纳米细菌培养阳性率无统计学差异(x2=1．669, P>0．05)．培养2 wk时,显微镜下可见做布朗运动的微小的颗粒状纳米细菌．4 wk时,可见纳米细菌开始贴附于培养瓶底部形成细菌被膜．培养所得纳米细菌与8D10 抗体产生特异性结合,电镜下观察呈球形或短棒状颗粒,大小约为80-350 nm．结论:在胆囊结石患者的胆汁中存在纳米细菌感染, “过滤法”是一种简单有效的预处理胆汁的方法．

间接法原位PCR检测喉鳞癌组织HPV感染

目的建立稳定的原位PCR方法 ,并探讨HPV感染与喉鳞癌发生的关系。方法采用免疫组化、原位杂交、PCR和间接原位PCR技术 ,检测了50例喉鳞癌中的HPV感染情况。结果免疫组化衣壳抗原阳性者6例(12 % ) ,原位杂交阳性者13例 (26 % ) ,PCR阳性者10例 (20 % ) ,原位PCR阳性者17例 (34 % ) ,综合上述方法的检出率为42 % (21例 )。结论HPV感染与喉癌有着明显的关系 ,间接原位PCR在检测HPV感染中具有较高的敏感性、特异性和可靠性 ,可以定性、定位。

成虫童虫冰冻切片抗原间接荧光抗体试验和免疫酶染色试验诊断肺吸虫病

以肺吸虫成虫童虫冰冻切片抗原片做间接荧光抗体试验（ＩＦＡＴ）及免疫酶染色试验（ＩＥＳＴ）对比检测９４份肺吸虫感染者和４０例正常健康人血清，两法的阳性率分别为９３．６％、９５．７％和８９．１％、９３．６％，假阳性率均为０。ＩＦＡＴ和ＩＥＳＴ对比检测３４份血吸虫病人血清，３５份华支睾吸虫病人血清和３０份肺结核病人血清。ＩＦＡＴ出现的交叉反应率为１４．７％、５．７％、０和１４．７％、８．６％、０。ＩＥＳＴ出现的交叉反应率为５．９％、０、０和８．８％、５．７％、０。结果表明两法用于肺吸虫病的诊断均有较高的敏感性和特异性，而且抗原定位好，ＩＥＳＴ不需荧光显微镜或荧光设备。