小鼠SGK3真核表达载体的构建及鉴定

目的构建含有小鼠血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶3(serum and glucocorticoid-induced protein kinase 3,SGK3)基因的真核表达载体pcDNA3.1-MYC-SGK3-mCherry,并观察和验证其在转染细胞HEK293中的表达。方法通过聚合酶链式反应将实验室保存的真核表达质粒pcDNA3.1-MYC-SGK3中目的基因SGK3与mCherry融合并扩增出来,然后定向克隆至pcDNA3.1-MYC质粒中,经限制性内切酶消化和测序证实后,通过脂质体法转染HEK293细胞,Western blotting法检测目的基因的蛋白表达情况。结果测序结果与之前预期结果相符,证实pcDNA3.1-MYC-SGK3-mCherry真核表达载体构建成功。Western blotting结果显示,转染pcDNA3.1-MYC-SGK3-mCherry的HEK293细胞出现清晰的阳性反应条带,说明目的片段成功表达。结论pcDNA3.1-MYC-SGK3-mCherry真核表达载体构建成功。

整合型诱导表达猪生长激素(pGH)载体的构建及表达研究

旨在构建整合型诱导表达猪生长激素(Porcine growth hormone,pGH)载体,在细胞水平验证其诱导效率及表达效率。从pTRE-GH12载体上扩增TRE-GH片段,通过Sal I酶切位点连接到pCAGGS-rtTA载体中,构建重组载体pCAGGS-rtTA-TRE-GH12(下称pTTGH),将pTTGH质粒转染猪PK15细胞,经G418筛选后,在培养液中添加诱导底物强力霉素(Doxycycline,DOX)后不同时间段通过实时荧光定量PCR(QRT-PCR)测定细胞内pGH mRNA的表达;在培养液中添加不同浓度的的DOX,通过QRT-PCR及Western blot测定细胞内pGH的表达变化。酶切及测序结果表明成功构建了pTTGH载体;QRT-PCR结果表明,和对照组相比,试验组细胞培养液中添加诱导底物后外源GH基因表达在36h时最高;在一定浓度范围内,外源GH表达水平和添加DOX的浓度呈现出正相关性,而正常细胞组中GH的表达水平不受DOX添加与否及量的影响。通过条带灰度分析Western杂交结果验证了培养基中一定范围内DOX浓度和pGH表达量呈现出正相关。试验结果表明,本研究成功构建了整合型诱导表达GH载体并能实现GH的可控表达,本研究为以后制备可控表达GH转基因动物、进一步研究GH对机体影响奠定基础。

突变低氧诱导因子1_α基因真核表达载体的构建和表达

目的构建人低氧诱导因子-1α(HIF-1α)真核表达载体pcDNA3.1+-HIF-1α的两种突变体pcDNA3.1+-HIF-1α-564Ala和pcDNA3.1+-HIF-1α-564Ala-803Ala,并检测它们在人肺微血管内皮细胞(HMVECs)中的表达。方法用定点突变的方法将pcDNA3.1+-HIF-1α的HIF-1α第564位脯氨酸(Pro)密码子CCC突变为丙氨酸(Ala)密码子GCC,构建成单个突变HIF-1α真核表达载体pcDNA3.1+-HIF-1α-564Ala。在第一次突变的基础上,仍然用定点突变的方法将pcDNA3.1+-HIF-1α-564Ala的HIF-1α-564Ala第803位天冬酰胺(Asn)密码子ATT突变为丙氨酸(Ala)密码子GCT,构建成双个点突变HIF-1α真核表达载体pcDNA3.1+-HIF-1α-564Ala-803Ala。将3种HIF-1α表达载体用脂质体法分别转入HMVECs,以RT-PCR、免疫荧光法和Westernblotting法分别对转染细胞进行表达分析。结果测序证实,定点突变成功,构建成重组真核表达载体pcDNA3.1+-HIF-1α-564Ala和pcDNA3.1+-HIF-1α-564Ala-803Ala;3种载体均能表达相应的蛋白和mRNA,但转化突变HIF-1α表达载体的细胞蛋白量比空白细胞和转化无突变HIF-1α载体的细胞显著增加。结论成功构建能够在HMVECs中表达的单个和双个点突变的HIF-1α基因的真核表达载体。

茶树PPO融合蛋白真核表达载体的构建与表达

以迎霜品种茶树基因组为模板,利用高保真聚合酶pfu,通过PCR方法扩增得到茶树PPO基因的编码区序列。通过设计酶切引物将其成功融合至真核表达载体pPICZa中,构建出茶多酚氧化酶的融合蛋白真核表达载体pPICZa-PPO,并将其转化进入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,成功筛选出多个阳性转化子。对阳性转化子进行甲醇诱导,采用Western-Blotting方法在培养液中成功检测到诱导表达的目的蛋白。酶活检测结果也显示诱导产物具有较高的相对酶活性,能够正确发挥酶蛋白的生物功能。

利用套叠PCR技术改造人可溶性TRAILcDNA片段及真核表达载体的构建

利用套叠PCR技术对可溶性TRAIL基因片段(sTRAIL,114aa-281aa)的“KEX2”位点及“ATTTA”位点分别进行改造,并构建真核表达载体;结果表明:成功获得了3种突变基因:sTRAILK、sTRAILA以及sTRAILAK,并成功构建了4种分泌型酵母表达载体:pPICZα-A-sTRAILK,pPICZα-A-sTRAILA,pPICZα-A-sTRAILAK以及pPICZα-A-sTRAIL.

四环素诱导性人肝细胞生长因子真核表达载体的构建与鉴定

目的构建四环素诱导性人肝细胞生长因子(HGF)真核表达载体。方法运用基因重组技术,将人HGFcDNA全长序列,定向克隆于四环素诱导性真核表达载体pBI-L多克隆位点MluI和SalI之间,限制性内切酶酶切和测序鉴定。结果重组pBI-L-HGF真核表达载体经限制性内切酶酶切,与理论值相符;测序结果与GenBank比对,序列正确。结论本实验成功构建人HGF四环素诱导性真核表达载体pBI-L-HGF,为今后临床开展HGF基因治疗提供了一种安全可调控的基因治疗策略。

携EGFP的人低氧诱导因子-1α真核表达载体的构建及表达

目的构建携EGFP的人低氧诱导因子(HIF-1α)真核表达载体,为研究人HIF-1α基因对冠心病的血管新生作用奠定基础。方法采用分子克隆技术,KpnⅠ、XbaⅠ双酶切pcDNA3.1/V5-HisA-HIF-1α获得HIF-1αcDNA,克隆到质粒pcDNA3.1(+),得到质粒pcDNA3.1(+)-HIF-1α,以KpnⅠ,ApaⅠ双酶切质粒pcDNA3.1(+)-HIF-1α获得HIF-1αcDNA,克隆到质粒pEGFP-c1得到pEGFP-HIF-1α-c1质粒。脂质体法转染HEK293细胞,用荧光显微镜和Western blotting检测EGFP和HIF-1α在HEK293细胞的表达。均显示融合蛋白在细胞中表达。结果经酶切鉴定及PCR证实重组pEGFP-HIF-1α-c1质粒构建成功,荧光显微镜和Western blotting显示EGFP和HIF-1α融合蛋白在HEK293细胞中表达。结论成功构建重组真核表达载体pEGFP-HIF-1α-c1并在HEK293细胞表达,为冠心病的HIF-1基因治疗研究奠定更直观的基础。

pcDNA3.1^+-HIF-1α载体的构建和初步表达鉴定

目的克隆和构建带人低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因真核表达载体pcDNA3.1+-HIF-1α。方法以大肠癌细胞株HT29的总RNA为模板,进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),获得HIF-1α的cDNA,克隆入T载体,测序证实后克隆入真核表达载体pcDNA3.1+,酶切鉴定重组子。将构建好的pcDNA3.1+-HIF-1α用脂质体法转入HEK293细胞,RT-PCR鉴定重组质粒的表达。结果扩增出HIF-1αcDNA全长,测序结果与Genbank记载完全一致,成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1+;建立了稳定的细胞株HEK293/pcDNA3.1+-HIF-1α。结论成功克隆和构建带人HIF-1α基因真核表达载体pcDNA3.1+-HIF-1α,并证明其能在真核细胞内表达。

GILZ真核表达载体的构建及其表达定位

目的:克隆、构建HA标签的糖皮质激素诱导亮氨酸拉链蛋白GILZ表达载体,观察其在细胞中表达与定位,为研究GILZ在脂肪细胞分化中的作用提供工具。方法:采用逆转录PCR(RT-PCR)法从C3H10T1/2细胞中扩增带有HA标签的GILZcDNA编码区,并将其重组于真核表达载体pcDNA3中。经酶切、序列鉴定分析后,将该重组质粒通过Lipofectamine2000脂质体和CaCl2方法,分别转染C3H10T1/2和293T细胞,用HA抗体免疫荧光和免疫印迹法检测GILZ在细胞内的表达、分布及分子量大小。结果:HA-GILZ表达载体经酶切鉴定和测序分析确认构建成功,并在C3H10T1/2和293T细胞中获得了高效表达。在荧光显微镜下,GILZ主要表达于细胞质内,分子量约20kD。结论:成功构建HA-GILZ基因表达载体并表达于C3H10T1/2细胞质中,为GILZ的功能研究奠定了基础。

AIF重组质粒的构建、表达和功能的研究

目的构建人凋亡诱导因子(AIF)基因功能片段的真核表达载体pcDNA3.1(+)AIF,并初步研究AIF在细胞凋亡中的作用。方法从人细胞中提取总RNA,RTPCR扩增AIF基因片段;克隆到pMD18T载体上,通过酶切和测序进行鉴定;将AIF基因片段插入pcDNA3.1(+),构建真核表达载体;电转化淋巴母细胞Raji细胞,观察AIF的表达水平和功能。结果成熟AIF蛋白分子在真核细胞中表达,并转移到细胞核中,诱导Caspase非依赖性细胞凋亡。结论成功构建了pcDNA3.1(+)AIF真核表达载体,AIF在Caspase非依赖性细胞凋亡中发挥重要作用。

可经米非司酮诱导的真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建一种可经米非司酮诱导的真核表达载体,并用荧光素酶报告基因鉴定其调控作用。方法:利用分子生物学技术,将萤火虫荧光素酶LUC基因和启动子,以及米非司酮调控系统构建成单一的质粒载体pDC—RULUC,为减少两个转录单元之间的潜在干扰,加入了1.2 kb的绝缘子。通过PCR扩增和限制性酶切及测序分析鉴定载体的正确性。利用Lipo- fectamine2000试剂盒转染载体pDC—RULUC至体外培养的SW620细胞,将载体pGL3-Control和pGL3-Basic的转染分别设为阳性和阴性对照组,各组均同时转染pRL-TK载体作为内参照。实验组细胞在不同浓度(0、1×10^(-5)、1×10^(-6)、1×10^(-7)、1×10^(-8)、1×10^(-9)、1×10^(-10)mol/L)的米非司酮培养液中孵育48 h后,采用双荧光素酶报告基因测试系统检测荧光素酶相对活性。复孔组则予去除培养液中的米非司酮并继续孵育48 h后行荧光素酶相对活性检测。结果:PCR和限制性酶切及测序均证实了载体的正确性。加入诱导剂米非司酮后,荧光素酶的相对活性随着培养液中米非司酮的浓度增高而增加,当米非司酮浓度达到1×10^(-6)mol/L时,最高可以实现荧光素酶的50余倍的表达,而去除诱导剂米非司酮后,几乎检测不到报告基因的表达。结论:成功构建了新型的米非司酮诱导调控系统载体,可以在体外实现对目的基因表达的有效调控,为进一步的基因调控研究和基因治疗奠定了基础。

APRIL shRNA表达载体的构建与筛选

目的构建并筛选有效的、编码短发夹RNA（shRNA）的增殖诱导配体（APRIL）基因特异性真核表达载体。方法分别设计、合成4对寡核苷酸单链，经退火、连接得到APRIL—shRNA双链，定向克隆至带有H1启动子、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因和Neo基因的pGCsi—H1／Neo／GFP质粒载体中，构建4条含APRIL基因shRNA的pGCsi—H1／Neo／GFP—APRIL—shRNA真核表达载体，转染高表达APRIL的结直肠癌细胞株SW480，G418筛选，荧光显微镜下观察转染效率，FQ—RT—PCR检测APRIL mRNA水平，Western印迹分析APRIL蛋白表达。结果测序证实pGCsi—H1／Neo／GFP—APRIL—shRNA（APRIL shRNA）构建成功，无碱基突变，4种不同shRNA质粒转染细胞后APRIL mRNA弄口蛋白表达差别有统计学显著性意义（P〈0．01）。结论成功地构建APRIL shRNA真核表达载体，敲低效率85％以上，可用于后续的实验研究。

小鼠TGFBI基因真核表达载体的构建和表达

目的构建小鼠TGFBI基因的真核表达载体,为研究角膜营养不良的发病机制奠定基础。方法提取BALB/cBy小鼠正常角膜组织总RNA,经反转录-PCR合成TGFBI cDNA,克隆入真核表达载体pcDNA3.1并测序验证。用不同剂量重组质粒pcDNA3.1-TGFBI转染NIH3T3细胞,通过SYBR荧光实时定量PCR和Western blot检测TGFBI在细胞中的表达。结果测序结果显示扩增到的TGFBI cDNA以正确序列和方式插入载体,实时定量PCR和Western blot结果显示TGFBI在NIH3T3细胞中表达增强。结论成功构建了小鼠TGFBI基因真核表达载体,并在细胞中进行表达,为进一步研究TGFBI在角膜内的生理、病理功能奠定基础。

pTARGET-TCR Vβ5.2真核表达质粒的构建及表达

目的构建含大鼠TCR Vβ5.2基因的重组真核表达质粒。方法以RT-PCR法扩增Lewis大鼠脾脏淋巴细胞的TCR Vβ5.2基因片段,将目的基因直接克隆到真核表达载体pTARGET中,构建重组质粒pTARGET-TCR Vβ5.2。连接产物转化E.coliJM109细胞后进行蓝白斑筛选,并经菌落PCR和DNA测序进行鉴定。将重组质粒以肌注法免疫Balb/c小鼠,用RT-PCR和免疫组化方法分别检测重组质粒在注射部位的转录和表达。通过脂质体介导,将重组质粒转染COS-7细胞进行瞬时表达,用免疫细胞化学染色法检测目的基因在真核细胞内的表达。结果测序鉴定证实,TCR Vβ5.2基因已被正确插入到pTAR-GET载体中,并检测到肌肉组织和COS-7细胞内目的蛋白的表达。结论成功构建了重组真核表达质粒pTARGET-TCR Vβ5.2,为进行TCR VβDNA疫苗对胶原诱导性关节炎大鼠保护作用的研究提供了基础。

DNA损伤诱导转录因子4过表达可能通过Wnt/β-catenin信号通路抑制HT-22细胞增殖并促进其凋亡

神经管畸形(neural tube defects,NTDs)是一种由细胞增殖凋亡紊乱引起的先天缺陷性疾病。本室前期利用RNA-Seq技术,发现小鼠神经管畸形胚胎脑组织中DNA损伤诱导转录因子-4(DNA damage-inducible transcript 4,Ddit4)表达水平增加,但其在神经管畸形中的作用尚不清楚。本文拟探索Ddit4过表达对海马神经元HT-22细胞增殖和凋亡的影响及相关机制,从而为后续研究Ddit4在小鼠神经管畸形中的作用奠定基础。本研究首先根据小鼠Ddit4序列构建真核表达载体pEX-3-Ddit4,限制性酶切分析和测序结果表明pEX-3-Ddit4构建成功。qRT-PCR和Western印迹检测显示转染pEX-3-Ddit4后,HT-22细胞中DDIT4的表达水平明显增加(P<0.01)。CCK-8和Western印迹结果显示,Ddit4过表达导致HT-22细胞增殖下降(P<0.01)。流式细胞仪结果显示,转染pEX-3-Ddit4后,G0/G1期细胞比例增加、S期比例下降(P<0.01),细胞凋亡率增加(P<0.05)。Western印迹检测发现,转染pEX-3-Ddit4能够显著上调切割胱天蛋白酶3(cleaved caspase3)水平(P<0.05),表明Ddit4过表达促进HT-22细胞凋亡。细胞免疫荧光及Western印迹结果显示,过表达Ddit4显著降低细胞β-联蛋白(β-catenin)、T细胞因子4、细胞周期蛋白D1和C-myc的表达水平(P<0.05),核内β-联蛋白减少,提示Ddit4过表达抑制了Wnt/β-catenin信号通路。过表达Ddit4的同时加入Wnt/β-catenin信号通路激动剂LiCl处理细胞可逆转上述现象,表明Ddit4过表达可能通过Wnt/β-catenin信号通路对HT-22细胞发挥抗增殖和促凋亡作用。

真核表达载体介导的ICOSIg基因在大鼠脂肪间充质干细胞中表达的实验研究

目的构建含可诱导共刺激分子(ICOS)融合蛋白(ICOSIg)基因的真核表达载体,探讨其能否在大鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)中表达。方法克隆编码大鼠ICOS的胞外片段,将其与编码人免疫球蛋白IgG Fc段的基因融合,构建ICOSIg融合基因及其分泌型真核表达载体pcDNA3.1(+)/ICOSIg。经测序鉴定后转染ADSCs,Western blot法检测ICOSIg在ADSCs中的表达。结果经测序鉴定验证pcDNA3.1(+)/ICOSIg质粒构建成功,且能在ADSCs中成功表达。结论ICOSIg在ADSCs中成功表达,为进一步研究免疫耐受机制提供了实验基础。

Tet-on Advanced调控人血管生素-1基因真核表达载体的构建、表达与鉴定

目的构建pTRE-Tight-Ang-1可调控性真核表达载体,并检测其在心脏细胞中表达的可调控性。方法巢式多聚酶链反应(nested PCR)从肺组织扩增Ang-l,测序正确后将其亚克隆入pTRE-Tight载体中,采用脂质体将pTet-on-Advanced质粒和pTRE-Tight-Ang-1共转染入新生SD大鼠心肌细胞,以不同浓度强力霉素(Dox)诱导,Western blot检测Ang-1蛋白表达水平。结果通过巢式PCR获得了Ang-1全长cDNA,与Genebank比对,序列完全一致。Western blot检测表明,所构建的pTRE-Tight-Ang-1可调控性表达载体能在心肌细胞内表达,表达量呈浓度依赖性。结论该实验成功构建pTRE-Tight-Ang-1真核表达载体,在心肌细胞中的表达受Dox的调控。

基于四环素诱导型Hnf1β和Foxa3表达载体的小鼠胚胎成纤维细胞转分化为肝干细胞的实验体系研究

目的:建立基于四环素诱导型Hnf1β和Foxa3表达载体的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)转分化为肝干细胞(iHepSCs-Dox)的诱导实验体系,为后续转分化过程所涉及的分子机制研究提供有效工具。方法:构建TetO-Hnf1β-EGFP和TetO-Foxa3-mCherry四环素诱导型慢病毒载体,经慢病毒介导将其转染入293FT细胞,利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测不同浓度的多西环素(Dox)诱导外源基因表达水平的差异,确定最佳Dox诱导浓度;将两个诱导型表达载体转染到MEF细胞中,参照先前建立的诱导体系,在合适的Dox浓度下启动Hnf1β和Foxa3基因的表达,诱导MEF细胞的转分化。对经过20 d诱导出现的上皮样细胞集落进行扩增,获得iHepSCs-Dox细胞系。利用CCK-8法、克隆形成实验、碱性磷酸酶染色、体外诱导分化以及反转录PCR(RT-PCR)等实验,对所获得的iHepSCs-Dox细胞系的生物学特性作鉴定,同时与前期获得的诱导型肝干细胞系(iHepSCs)作对比,以此对基于四环素诱导型表达载体的转分化体系的诱导效果进行评价。结果:qPCR结果显示,在培养基中添加100 ng/mL的Dox作用24 h即可启动外源基因表达,撤去Dox 48 h后,外源基因的表达显著降低甚至关闭;RT-PCR结果显示,iHepSCs-Dox细胞表达胆管细胞的标志(CK19)、肝胆共同标志(CK18)以及肝脏干/前体细胞标志(Dlk1、Sox9、EpCAM),碱性磷酸酶染色结果显示阳性;具有形成克隆的能力;能够在体外诱导分化为肝干细胞,以上干性特征与前期构建的iHepSCs具有较大相似性。当从培养基中撤掉Dox之后,随着双因子表达的停止,iHepSCs-Dox细胞的增殖速率明显下降,CK18、EpCAM的表达下调;失去克隆形成能力,在体外无法诱导其分化为肝细胞。结论:成功建立了基于四环素诱导型双转录因子表达载体的MEF细胞转分化为肝干细胞的诱导体系,该诱导体系可以作为后续研究转分化过程中所涉及的分子机制的有效工具。另外,结果提示外源基因的持续表达是iHepSCs-Dox细胞干性维持的必要条件。

真核表达载体PcDNA3.0-AIF△1-480构建及其促凋亡活性的研究

目的:构建AIF截短后只保留羧基端促凋亡结构域的真核表达载体,了解其是否有促凋亡活性作用及其机制。方法:通过PCR方法构建出AIF截短体AIF△1-480的真核表达载体。采用脂质体将该载体瞬时转染人乳腺癌细胞系MCF-7细胞,采用流式细胞技术检测其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用,同时采用JC-1流式细胞技术检测其对线粒体膜电位的影响。选取5～7周龄BALB/c雌性裸鼠35只,构建荷瘤裸鼠模型,并在体内实验中检测该载体的促凋亡活性作用。结果:成功构建真核表达载体PcDNA3.0-AIF△1-480,并经酶切鉴定和DNA测序证明。在体外实验中,与对照组相比该载体能够诱导MCF7细胞发生凋亡,对照组、PcDMA3.0组和PcDNA3.0-AIF△1-480组凋亡率分别为0.01%、16.01%和28.55%。同时MCF7细胞转染该载体后能够使线粒体膜电位发生去极化,导致凋亡的发生,对照组、PcD-MA3.0组和PcDNA3.0-AIF△1-480组凋亡率分别为2.26%、60.37%和95.78%。在荷瘤裸鼠模型中,转染该载体后能够抑制肿瘤的生长,至观察终点中位肿瘤体积分别为1 187.2、1 000.0和609.4mm3。结论:截短后只保留羧基端的AIF仍然有促凋亡活性作用,其机制是通过改变线粒体膜电位来发挥促凋亡作用。

凋亡诱导因子AIF基因真核表达载体的构建及表达

目的利用TA克隆法构建凋亡诱导因子(AIF)的真核表达载体AIF-pcDNA3.1(+),并研究其在人肺腺癌A549细胞中的表达。方法根据GenBank上AIF的mRNA序列设计特异性引物,以A549细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增AIF基因。并用TA克隆法,将AIF目的基因连接到pUC-T载体,行双酶切和DNA测序鉴定;回收目的片段并将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)构建重组质粒AIF-pcDNA3.1(+)。最后,将AIF-pcDNA3.1(+)转染A549细胞,RT-PCR和Western blot检测转染细胞AIF基因的表达。结果成功扩增617bp的AIF目的基因片段并连接pUC-T载体,测序后回收目的片段并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,DNA序列分析显示,连接在真核表达载体上的基因片段与GenBank中的AIF序列完全吻合。RT-PCR和Western blot检测结果显示,转染了AIF-pcDNA3.1(+)的A549细胞AIF mRNA和蛋白表达水平均高于未转染细胞(P<0.05)。结论成功构建了真核表达载体AIF-pcDNA3.1(+),转染后能够在A549细胞中表达。