Preparation, characterization and in vivo evaluation of alginate-coated chitosan and trimethylchitosan nanoparticles loaded with PR8 influenza virus for nasal immunization

For efficient mucosal vaccine delivery, nanoparticulate antigens are better taken by microfold cells in the nasal associated lymphoid tissue and also dendritic cells. Nanoparticles based on polymers such as chitosan(CHT) and its water soluble derivative, trimethylchitosan(TMC), could be successfully used as carrier/adjuvant for this purpose. Sodium alginate, a negatively charged biopolymer, could modify the immunostimulatory properties of CHT and TMC NPs and increase their stability. Sodium alginate(ALG)-coated chitosan(CHT)and trimethylchitosan(TMC) nanoparticles(NPs) loaded with inactivated PR8 influenza virus were successfully prepared by direct coating of the virus with CHT or TMC polymers to evaluate their immunoadjuvant potential after nasal immunization. After nasal immunizations in BALB/c mice, PR8-CHT formulation elicited higher IgG2 a and Ig G1 antibody titers compared with PR8-TMC. ALG coating of this formulation(PR8-CHT-ALG) significantly decreased the antibody titers and a less immune response was induced than PR8-TMC-ALG formulation. PR8-TMC-ALG formulation showed significantly higher Ig G2 a/Ig G1 ratio, as criteria for Th1-type immune response, compared with PR8-CHT-ALG and PR8 virus alone. Altogether, the PR8-TMC-ALG formulation could be considered as an efficient intranasal antigen delivery system for nasal vaccines.

复方中药对流感病毒A/PR/8/34(H1N1)感染小鼠淋巴细胞功能和细胞因子的影响

目的观察复方中药对流感病毒A/PR/8/34(H1N1)感染小鼠淋巴细胞功能和细胞因子的影响。方法90只BALB/c小鼠随机分为6组,每组15只,分别为空白对照组、模型对照组、盐酸金刚烷胺对照组(100 mg/kg)、复方中药高剂量组(1.5 g/kg)、中剂量组(0.75 g/kg)与低剂量组(0.375 g/kg)组。中药组连续灌胃2 d后,空白对照组滴鼻生理盐水,其他5组小鼠滴鼻流感病毒感染建立流感病毒小鼠模型,模型建立4 h后空白对照组和模型对照组灌胃去离子水,药物组灌胃不同剂量药物,连续5 d。灌胃结束后无菌取血,小鼠安乐死,取胸腺和脾脏,计算胸腺指数和脾脏指数;采用MTT测定各组的T、B淋巴细胞转化率;ELISA检测肺组织中的细胞因子IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ水平。结果与空白对照组相比,模型对照组胸腺指数和脾脏指数,T、B淋巴细胞A值,IL-10和IFN-γ显著下降,TNF-α和IL-6显著升高(P<0.01);与模型对照组相比,复方中药中剂量组胸腺指数和脾脏指数,T、B淋巴细胞A值,IL-10和复方中药高剂量组IFN-γ显著增高,复方中药中剂量组IL-6显著下降(P<0.05),复方中药中、低剂量组TNF-α显著下降,IFN-γ显著升高(P<0.01)。结论复方中药通过调节机体淋巴细胞功能和细胞因子分泌水平,从而改善肺部炎症,是治疗病毒性流感的作用机制之一。

热毒宁吸入溶液对甲型流感病毒A/PR/8/H1N1感染所致小鼠病毒性肺炎的药理作用研究

目的探讨热毒宁吸入溶液对甲型流感病毒A/PR/8/H1N1感染小鼠致肺炎模型的药理作用,为临床应用提供基础。方法实验动物按体质量随机分为8组,分别为正常对照组、模型对照组、利巴韦林对照组、热毒宁注射给药对照组,热毒宁雾化吸入给药高剂量组0.23 g生药/kg(20 min)、中剂量组0.12 g生药/kg(10 min)、低剂量组0.06 g生药/kg(5 min)和极低剂量组0.03 g生药/kg(2.5 min)。采用甲型流感病毒A/PR/8/H1N1感染小鼠致肺炎模型,通过检测肺指数、肺部病理变化及肺组织中病毒载量、炎症因子白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量等指标评价热毒宁吸入溶液治疗流感病毒性肺炎的药理作用。结果热毒宁吸入溶液4个剂量组均可不同程度上降低小鼠肺指数、减轻肺组织病理损伤、降低病毒载量及减少IL-6、TNF-α的含量。结论热毒宁吸入溶液雾化吸入给药对甲型流感病毒A/PR/8/H1N1感染所致小鼠病毒性肺炎具有显著治疗作用。

一个复方中药处方对流感病毒A/PR/8/H1N1感染小鼠肺损伤的影响

目的观察一个复方中药处方对流感病毒A/PR/8/H1N1感染小鼠所致肺损伤的影响。方法将90只雌性BALB/c小鼠随机分为空白对照组、病毒对照组、盐酸金刚烷胺组和复方中药高、中、低剂量组等6组,每组15只。中药组连续灌胃2 d后,小鼠滴鼻感染建立流感病毒小鼠模型,空白对照组滴鼻生理盐水。病毒感染4 h后各组分别灌胃不同剂量药物或生理盐水,再连续灌胃5 d。感染第5天时,计算各组BALB/c小鼠肺指数,测定肺组织匀浆的血凝滴度,并观察肺组织病理形态学。结果与病毒对照组相比,盐酸金刚烷胺组和复方中药制剂中剂量组肺指数显著降低(P<0.01),复方中药制剂低剂量组和复方中药制剂高剂量组肺指数显著降低(P<0.05);各药物组小鼠肺组织血凝滴度均显著降低(P<0.01);各药物组小鼠肺组织病理形态学均有不同程度的改善。结论本研究所用的复方中药处方对流感病毒A/PR/8/H1N1感染的小鼠平均肺指数和平均血凝滴度有明显的降低作用,对其所致肺损伤有明显的改善作用。

宣肺败毒颗粒增加T细胞数量减轻流感病毒肺炎的机制研究

[目的]确定宣肺败毒颗粒在低温高湿环境下,A/PR/8/34(H1N1)流感病毒肺炎小鼠模型的治疗效果及作用机制。[方法]将ICR小鼠置于具有低温高湿环境的人工气候箱中,滴鼻给予流感病毒(A/PR/8/34)建立流感病毒肺炎模型。造模后第5天对小鼠每日给予宣肺败毒颗粒灌胃5 d,观察记录小鼠的行为学评分、体质量、脏器指数、肺部病毒载量、肺部影像学及形态学变化,蛋白印迹法检测炎症关键蛋白NF-κB的表达变化,流式细胞术检测宣肺败毒颗粒对小鼠免疫应答的调节。[结果]与模型组相比,宣肺败毒颗粒给药后小鼠表现出活跃程度上升、大便性状正常、肺部病毒载量降低、小鼠肺部炎性渗出减少,p-NF-κB P65表达降低,CD4+和CD8+T细胞百分比增高。[结论]宣肺败毒颗粒增加T细胞数量,减轻流感病毒肺炎小鼠的炎症反应。

荆芥挥发油及其主要成分抗流感病毒作用与机制研究

目的:体内、体外实验观察荆芥挥发油及主要成分薄荷酮、胡薄荷酮的抗甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)作用及其Toll样受体/干扰素(toll-like receptor/interferon,TLR/IFN)信号通路机制。方法:制备流感病毒性肺炎模型小鼠,以预防和治疗方式给药,测定模型动物肺组织病毒滴度以评价药物体内抗H1N1效应。ELISA法观察药物对模型小鼠血清干扰素-α(interferon-alpha,IFN-α),干扰素-β(interferon-beta,IFN-β),白介素-2(interleukin-2,IL-2),白介素-6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)水平的影响及病毒感染狗肾传代细胞(Madin-Darby canine kidney cell,MDCK)上清液中IFN-β分泌水平的影响。实时荧光定量RT-PCR法观察药物对病毒感染MDCK细胞白介素1受体相关激酶-4(IL-1R-associated kinase-4,IRAK4)与Toll样受体3(toll-like receptor-3,TLR3)mRNA表达水平的影响。结果:体内实验表明,荆芥挥发油0.226 mg.kg-1、薄荷酮0.5 mg.kg-1及胡薄荷酮0.19 mg.kg-1治疗方式给药明显降低感染小鼠肺组织病毒滴度;荆芥挥发油0.226 mg.kg-1明显升高感染小鼠血清IFN-α,IL-2含量;薄荷酮0.5 mg.kg-1显著提高血清IFN-β含量。薄荷酮0.5 mg.kg-1、胡薄荷酮0.19 mg.kg-1明显降低病毒感染小鼠血清IL-6含量。荆芥挥发油0.452,0.226 mg.kg-1及胡薄荷酮0.19 mg.kg-1明显降低模型小鼠血清TNF-α含量。体外实验显示,荆芥挥发油0.1 g.L-1、胡薄荷酮0.1 g.L-1显著升高感染细胞上清液中IFN-β含量,并使细胞IRAK4 mRNA表达水平显著升高;薄荷酮0.25 g.L-1使感染细胞IRAK4 mRNA表达显著增强,但明显降低TLR3 mRNA表达。结论:荆芥挥发油、薄荷酮及胡薄荷酮治疗方式给药能显著降低病毒感染小鼠肺组织病毒滴度,显示出体内抗病毒作用,但预防给药效果不明显。体内抗病毒感染机制与提高感染小鼠干扰素(IFN-α,IFN-β),IL-2水平,抑制IL-6,TNF-α分泌有关;细胞模型结果提示药物通过TLR3和TLR7信号通路影响IFN-β的表达。

桂枝挥发油与桂皮醛对病毒性肺炎小鼠细胞因子及T细胞亚群的影响

目的:研究桂枝挥发油及主要成分桂皮醛抗甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)作用及其抗病毒作用机制。方法:KM小鼠70只随机分为7组,分别为正常组,模型组,利巴韦林组(0.15 g·kg-1),桂枝挥发油高、低剂量组(0.348,0.174mg·kg-1),桂皮醛高、低剂量组(0.264,0.132 mg·kg-1),每组10只。将浓度为30 LD50的H1N1病毒液50μL注入小鼠气管,复制病毒性肺炎模型小鼠,观察连续ig给药5 d对模型小鼠肺组织血凝滴度的抑制作用;ELISA法观察上述组别连续ig给药5 d对模型小鼠血清细胞因子白细胞介素-2(IL-2),IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)分泌量的影响;流式细胞仪法测定桂枝挥发油0.348 mg·kg-1,桂皮醛0.264 mg·kg-1,正常组,模型组及利巴韦林组连续ig给药5 d对模型小鼠外周血T细胞亚群的影响。结果:与正常组比较,模型组小鼠肺组织血凝滴度,小鼠血清IL-6,TNF-α含量明显升高,小鼠外周血CD4+/CD8+,小鼠血清IL-2含量明显降低(P<0.05);与模型组比较,桂枝挥发油0.348 mg·kg-1,桂皮醛0.264 mg·kg-1能明显降低模型小鼠肺组织血凝滴度(P<0.05),桂皮醛0.264 mg·kg-1和桂枝挥发油0.348 mg·kg-1分别显著降低模型小鼠血清IL-6,TNF-α含量(P<0.05),桂皮醛0.264 mg·kg-1可使模型小鼠外周血CD4+/CD8+明显升高(P<0.05),各药物对小鼠血清IL-2含量的影响并不明显。结论:桂枝挥发油、桂皮醛治疗给药能明显降低模型小鼠肺组织血凝滴度,表现出较好的抗流感病毒作用。抗病毒机制与调控模型小鼠血清细胞因子IL-2,IL-6,TNF-α分泌水平及提高外周血T细胞亚群的比例有关。

桂枝挥发油与桂皮醛对病毒性肺炎小鼠死亡保护作用及TLR/IFN信号机制研究

目的:观察桂枝挥发油、桂皮醛的抗甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)作用,探讨其TLR/IFN信号通路机制。方法:制备流感病毒性肺炎小鼠模型,观察药物对模型小鼠的死亡保护作用;ELISA法测定模型小鼠血清IFN-α、IFN-β水平,Real-Time PCR法测定模型小鼠肺组织TLR7、MyD88、TRAF-6 mRNA的表达量。结果:桂枝挥发油0.348 mg/kg,桂皮醛0.264 mg/kg、0.132mg/kg治疗给药,及桂枝挥发油0.348 mg/kg预防给药,均能明显提高模型小鼠的死亡保护率。桂枝挥发油0.348 mg/kg显著提高模型小鼠血清IFN-α含量及肺组织TLR7 mRNA表达水平,桂皮醛0.264 mg/kg显著升高IFN-β含量。结论:桂枝挥发油、桂皮醛能提高流感病毒性肺炎小鼠的死亡保护率,表现出抗流感病毒作用,抗病毒作用机制与激活TLR7信号通路,促进IFN的分泌有关。