单增李斯特菌(LM90)inlA单基因及inlB/inlA双基因缺失株的构建及其生物学特性初步研究

为探究内化素inlA、inlB基因缺失对单核细胞增生性李斯特菌(LM)生物学特性的影响,本研究采用同源重组技术构建了inlA基因缺失株(LM90-inlA)和inlB、inlA双基因缺失株(LM90-ΔinlB/ΔinlA),并对其生物学特性进行了初步研究。结果显示:PCR和测序结果证实成功构建了目的基因(inlA、inlB)缺失株;菌落PCR和测序结果显示2种缺失株在体外连续培养20代过程中均能稳定遗传;生长特性实验表明2种缺失株与亲本株生长差异无统计学意义(t_(LM90/LM90-ΔinlA=0.34),p>0.05;t_(LM90/LM90-ΔinlB/ΔinlA)=0.324,p>0.05;t_(LM90-ΔinlA/LM90-ΔinlB/ΔinlA)=0.008,p>0.05)且inlA缺失后2缺失株对小鼠的LD_(50)分别升高了0.64、1.26个对数数量级。研究结果表明inlA基因和inlB基因对LM90的部分生物学特性具有一定的调控作用,这对于阐明LM毒力因子的致病机理提供了参考依据,也为研究内化素介导LM穿越血脑屏障(BBB)的作用机制奠定了科学基础。

单增李斯特菌inlB基因缺失株的构建及其生物学特性

为探究单增李斯特菌inlB基因缺失株的生物学特性,利用同源重组技术成功构建了inlB基因突变株(LM90-△inlB)。对突变株进行了溶血试验、细菌计数小鼠肝、脾和脑载菌试验测定、体外耐酸碱生长培养试验及鼠脑微血管内皮细胞侵袭、黏附、增殖试验。结果显示,突变株溶血活性无变化;小鼠肝脏载菌量突变株低于亲本株,但差异不显著,脾脏载菌量无差异;突变株的毒力显著降低,对小鼠半数致死剂量比野生型菌株有明显升高(P<0.05);在体外耐酸碱生长能力培养中,inlB突变株耐酸性没有改变,而耐碱能力强于亲本株;细胞黏附侵袭及增殖试验表明突变株明显低于亲本株(P<0.05)。说明inlB基因对LM90的毒力具有一定的调控作用,结果对于阐明LM毒力因子的致病机理提供了科学依据。

单核细胞增生李斯特菌毒力基因inlB/actA双缺失突变株的构建

单核细胞增生李斯特菌inlB和actA毒力基因的编码产物InlB和ActA是与其致病性相关的重要毒力因子,与该菌在细胞间扩散、传播有着直接的关系,其中肌动蛋白聚集因子ActA是细菌由细胞浆扩散至相邻细胞所必须的因子,而内化素InlB在对肝细胞的侵袭过程中起着重要作用。本研究中利用同源重组技术在inlB缺失菌株基础上成功构建了毒力基因inlB和actA双缺失的突变株,获得减毒突变株,为构建预防人类和动物疾病的疫苗载体奠定了基础。

环境因素对单增李斯特菌inlB毒力基因表达的影响

针对单增李斯特菌毒力基因inl B设计五对引物,从中筛选出一对特异性强的引物,利用反转录荧光定量PCR技术来考察毒力基因表达的强弱。在不同环境因素条件下培养单增李斯特菌,分别提取菌体RNA,继而合成c DNA,以管家基因16S r RNA为内参基因,利用循环阈值（Ct）的变化计算inl B基因的相对表达量。结果表明,毒力基因inl B在温度为15℃、p H为6、氯化钠浓度为1.5%~2.0%、蔗糖浓度为0.75%~1.25%时能高效表达;温度为0℃和45℃、p H为4和9、氯化钠浓度为3.5%以上以及蔗糖浓度为0%~0.25%和2.25%以上时,对毒力基因inl B的表达起明显的抑制作用;在p H为6的条件下,酸的种类对毒力基因inl B的表达影响不大。

InlA／InlB基因的双缺失对单增李斯特菌毒力的影响

为了探讨InlA/InlB对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)毒力的影响,本研究利用同源重组技术在LM△InlA菌株的基础上构建LMInlA/InlB基因双缺失株。通过小白鼠肝脾脑细菌计数、LD50和溶血实验,研究LM在InlA/InlB基因缺失后毒力上的差异。结果显示:LM△InlA/△InlB基因双缺失株与LM菌株相比,双缺失株的LD50升高2个数量级;与LM△InlA、LM△InlB菌株相比,双缺失株的LD50均升高1个数量级;双缺失菌株在小白鼠肝脏、脾脏和脑组织内的载菌量均显著减少(P<0.05);但没有改变其溶血特性。结果提示,InlA/InlB基因双缺失后,LM菌株的毒力能够明显减弱,但不改变其溶血特性。

单增李斯特菌inl A/inl B双基因缺失株生长特性观察及对小鼠致病性研究

目的探究单增李斯特菌inl A/inl B双基因缺失株的生物学特性。方法通过体外胁迫培养条件下OD600测定以及小鼠感染试验,对Lm90-△inlAB和Lm90的抗胁迫能力及细菌致病力进行研究。结果低温(4℃、30℃)环境下,Lm90和Lm90-△inlAB生长差异无统计学意义(t4℃=0.057,P>0.05;t30℃=0.441,P>0.05),适温37℃及42℃高温环境下,Lm90-△inlAB较Lm90生长受到抑制,生长差异具有统计学意义(t37℃=0.763,P<0.05;t42℃=1.147,P<0.05);体外耐酸碱试验中,Lm90-△inlAB耐酸性未明显改变,而耐碱能力强于亲本株Lm90,生长差异具有统计学意义(pH=9时t=2.837,P<0.05);在含有3.5%酒精的BHI培养基及含5%NaCl高渗BHI培养基中,Lm90-△inlAB增长趋势明显低于Lm90,生长差异具有统计学意义(t酒精=1.422,P<0.05;tNaCl=1.382,P<0.05),Lm90-△inlAB对酒精及高盐的耐受力显著低于Lm90;小鼠毒力测定结果表明,Lm90-△inlAB与Lm90半数致死量分别为106.94 CFU、105.68 CFU,Lm90-△inlAB毒力下降明显,在不同检测时间点Lm90-△inlAB在小鼠肝脏和脾脏内的载菌量均少于Lm90,载菌量差异具有统计学意义(t肝=2.454,P<0.05;t脾=2.443,P<0.05)。结论 Lm的抗胁迫能力可能随着基因的缺失发生显著改变,内化素InlA/InlB与单增李斯特菌侵染宿主的能力有一定的调控作用。缺失株生物学特性测定对研究Lm胁迫环境生存及毒力因子的致病机理提供了科学依据。

实时荧光环介导等温扩增技术检测熏肉中单增李斯特氏菌的研究

建立一种实时荧光环介导等温扩增方法(Real-Time Fluorescence Loop-mediated Isothermal Amplification,RTF-LAMP)来快速、灵敏地检测熏肉中单增李斯特氏菌。针对单增李斯特氏菌的特异性基因inl B设计4条LAMP引物,并建立一套最优的RTF-LAMP反应体系。对该方法进行特异性验证,同时对灵敏度和人工污染熏肉的检出限进行测定。3株单增李斯特氏菌被检测为阳性,17株非单增李斯特氏菌为阴性。表明引物具有良好的特异性。RTF-LAMP和传统LAMP检测单增李斯特氏菌的灵敏度分别为1.1×10~1、1.1×10~2 CFU/m L。通过对熏肉进行人工污染,得出RTF-LAMP的检出限为3.5×10~1 CFU/g。通过与国标方法GB 4789.30—2016进行对比并计算RTF-LAMP反应的敏感性,特异性和准确度,结果分别为100.00%、98.44%和98.46%。研究建立的RTF-LAMP能够实时、快速地检测熏肉中单增李斯特氏菌,具有良好的应用前景。