人纤维介素蛋白2在昆虫杆状病毒系统中的表达及活性检测

目的:利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞(Sf9细胞)中表达人纤维介素蛋白2(hfgl2)凝血酶原酶并检测其蛋白活性。方法:首先将PCR扩增的目的基因hfgl2和pENTR/D-TOPO载体连接,再将pENTR/D-TOPO-hfgl2质粒与BaculoDirectTM线性DNA进行体外基因重组,采用脂质体转染法将重组DNA转染到生长良好的Sf9细胞中进行病毒包装,经过对重组杆状病毒三轮扩增后,用RT-PCR和Western blotting从基因和蛋白水平检测hfgl2表达情况,一期凝固试验检测其蛋白活性。结果:重组杆状病毒感染后,Sf9细胞停止生长,体积变大,细胞开始悬浮,破裂,呈现颗粒样外观。RT-PCR扩增和Western blotting从基因和蛋白水平证实Sf9细胞能够表达hfgl2,蛋白分子量约为63kDa。同时,在细胞上清液中检测到了可溶性hfgl2的表达,蛋白分子量约为50kDa。一期凝固试验证明表达的跨膜型hfgl2具有凝血活性。结论:hfgl2在昆虫杆状病毒表达系统中成功表达并具有生物学活性,为进一步研究hfgl2跨膜型以及可溶性蛋白功能提供了工具,亦可应用于开发重型肝炎蛋白芯片或ELISA诊断试剂盒。

水稻瘤矮病毒S3和S8基因共表达杆状病毒转移载体构建及重组病毒的鉴定

为构建携带水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)主要内层衣壳蛋白S3基因和外层衣壳蛋白S8基因的重组杆状病毒,将目的基因(S3和S8)分别亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual多角体启动子(PH)和p10启动子的下游.经酶切和确证性序列测定,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,获得重组杆粒rbpFBDS3-S8,采用脂质体转染法,将rbpF-BDS3-S8转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞包装病毒,PCR筛选鉴定重组病毒.结果表明:Sf9昆虫细胞被侵染72 h后,倒置显微镜下观察到细胞增大,培养液和细胞内出现颗粒状物质,部分细胞破裂甚至裂解,说明S3和S8基因已整合到重组杆状病毒基因组中,这为开展RGDV主要结构蛋白在昆虫细胞中的表达及其功能研究奠定了基础.