PDT/GR-ΔLBD融合蛋白的表达、纯化及穿膜特性的鉴定

目的构建穿膜肽(PDT)和缺失结合配体结构域的小鼠糖皮质激素受体(GR-ΔLBD)融合基因表达载体,经原核表达、纯化后,进行穿膜特性的鉴定。方法质粒pEGFP-GR-ΔLBD经双酶切,获得目的基因片段GR-ΔLBD,将该基因片段亚克隆入原核表达载体pGEX-PDT,获得pGEX-PDT/GR-ΔLBD融合基因表达载体。将表达载体转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达、谷胱甘肽-琼脂糖树脂处理、谷胱甘肽洗脱液洗脱后,获得PDT/GR-ΔLBD融合蛋白,SDS-PAGE分析融合蛋白;采用荧光素FITC体外标记PDT/GR-ΔLBD融合蛋白(终浓度分别为0、500、1000nmol/L),与小鼠肺上皮细胞TC-1共培养2h,在荧光显微镜下观察其穿膜特性。结果成功构建了融合基因原核表达载体pPDT/GR-ΔLBD,并能表达蛋白产物,大小约78.6kD,与融合蛋白PDT/GR-ΔLBD的理论计算值(80kD)相符。随着PDT/GR-ΔLBD浓度的增加,进入TC-1上皮细胞的PDT/GR-ΔLBD明显增多,并可在胞核中浓聚。结论 PDT/GR-ΔLBD融合蛋白具有良好的可溶性和穿膜特性,为进一步研究PDT/GR-ΔLBD融合蛋白在抗炎过程中的作用奠定了基础。