穿膜蛋白KAI1与intergrinα5β1、FAK在肺癌组织中的表达及其临床意义

目的本试验通过研究KAI1(Kang-ai-1)、intergrinα5β1和FAK基因编码的蛋白(focal adhesion kinase)产物在肺癌组织中的表达及其与临床病理学参数之间的关系,探讨它们在肺癌发生、发展、浸润、转移中的作用。方法应用免疫组化S-P方法检测非瘤肺组织、原发癌和转移癌中KAI1、intergrinα5β1和FAK蛋白的表达。结果在非瘤肺组织、肺癌组织和淋巴结转移癌中KAI1蛋白阳性表达率分别为100.0%,24.7%和0%,(P<0.01)。intergrinα5β1分别为0.0%,49.4%和83.3%(P<0.01),FAK分别为10.0%,48.3%和83.3%,(P<0.01),3个指标在三组之间的差异均具有统计学意义。KAI1和intergrinα5β1及FAK蛋白在肺癌组织中的表达都与患者的年龄、性别、肿瘤的大体类型无关,而与肿瘤的分化程度、临床分期密切相关。KAI1与intergrinα5β1呈显著负相关,intergrinα5β1与FAK呈显著正相关。结论KAI1与intergrinα5β1、FAK的异常表达与肺癌的浸润转移密切相关,检测这3项指标对预测肺癌的进展有一定的参考价值。

微沟槽形貌对人牙龈成纤维细胞整联蛋白intergrin α_5、β_1表达的影响

目的:研究微沟槽形貌对人牙龈成纤维细胞(HGF)整联蛋白intergrinα5、integrnβ1表达的影响。方法:用光刻技术制作沟槽宽度分别为15、30、60μm,沟槽深度分别为5、10μm(沟槽间隔分别等于各相应宽度)的微沟槽形貌,分别命名为T15/5、T15/10、T30/5、T30/10、T60/5、T60/10,光滑钛(T0)表面作为对照组;分别测量各组材料表面的微沟槽形貌及亲水性,用Real time-PCR和Western blotting检测HGF在各组材料表面培养3 d时的intergrinα5和β1mRNA及蛋白的表达水平。结果:T60/5表面亲水性最好,T15/10疏水性最大并明显大于光滑组T0(P<0.05);intergrinα5mRNA表达水平以T60/10组最高,而T15/10时最低,各组间两两相比P<0.05;沟槽宽度较小时(T15、T30),若深度增加则可减少intergrinα5mRNA的表达,而沟槽宽度较大时(T60),若深度增加则可促进intergrinα5mRNA的表达;intergrinβ1mRNA的表达水平以T60/10组最高,与其他各组相比P<0.05;其余3组间比较均P>0.05,intergrinα5、intergrinβ1蛋白的表达趋势与其mRNA的表达基本一致。结论:intergrinα5和β1表达随着沟槽宽度增大而增加,深度对intergrinα5表达的影响与沟槽的宽度大小相关,沟槽宽度和深度对intergrinβ1表达的影响程度低于intergrinα5。

基于“肝受气于心,传之于脾”探讨血流剪切力调控冠心病的相关机制

“肝受气于心,传之于脾”包括肝脾同治的理念。肝脾居中焦,调节各脏腑之气机升降出入,正所谓“气有余,则制己所胜而侮所不胜”,肝脾功能失衡,可祸及于心。研究发现疏肝健脾祛痰法能够调节miR-155水平,上调胆固醇跨血管内皮转运主要受体ABCA1,减少胆固醇沉积,改善冠脉血流量,但具体机制尚不明确。新近研究表明,血流剪切应力感受器Integrin激活可致miR-155核内启动下游基因转录。基于前期基础结合国内外研究进展,关注环境因素和生活方式对冠心病形成的作用,提出“肝郁脾虚,痰浊内生”乃AS重要病机,揭示《内经》藏象理论心病防治新策略的科学内涵,为中医从肝脾防治冠心病提供科学依据。

粪便整合素α_(4)基因甲基化检测在结直肠癌中的研究进展

整合素α_(4)(ITGA4)是整合素的一个亚单位,ITGA4基因启动子高频甲基化与结直肠癌(CRC)的发生发展密切相关,粪便中脱落的癌细胞包含稳定的可用于检测CRC的基因产物,其中ITGA4基因被认为是CRC早期筛查的有效分子生物标志物。目前,已设计出多种早期筛查CRC的分子生物标志物,但对其在CRC治疗评估及监测预后方面的研究相对较少,与同类型分子生物标志物相比,ITGA4基因异常甲基化可能在CRC治疗评估和预后预测方面具有更大的潜在价值,有望在CRC临床诊治中发挥良好的作用。

小檗碱对糖尿病肾病大鼠nephrin、podocin和α3β1整合素表达的影响

目的观察小檗碱对糖尿病肾病大鼠肾脏足细胞相关蛋白nephrin、podocin和α3β1整合素蛋白表达的影响,探讨小檗碱对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用及部分机制。方法采用高糖高脂饲料喂养6周,联合低剂量链脲佐菌素诱导糖尿病肾病大鼠模型。随机分为正常对照组、模型组、3个不同剂量(50、100和200 mg·kg-1)小檗碱给药组和依那普利阳性药对照组(1 mg·kg-1)。分别采用免疫组织化学法,油镜(×1 000倍)和高倍镜(×400倍)和Western blot法,观察和检测肾脏足细胞相关蛋白nephrin、podocin及α3β1整合素的分布和表达水平。结果足细胞相关蛋白nephrin、podocin及α3β1整合素蛋白主要分布于足细胞,但分布位置略有差异;与正常对照组相比,模型组大鼠的足细胞相关蛋白nephrin、podocin及α3β1整合素的表达水平明显降低;与模型组相比,小檗碱(100和200 mg·kg-1)给药组明显改善糖尿病肾病大鼠肾脏形态学异常,上调足细胞相关蛋白nephrin、podocin及α3β1整合素的表达水平。结论小檗碱可以缓解糖尿病肾病大鼠肾脏病理异常改变及蛋白尿的产生,这可能与其上调足细胞相关蛋白nephrin、podocin及整合素α3β1的表达相关。

整合素α_2、α_3在小鼠肾发育过程中的表达

目的:观察细胞外基质(ECM)受体-整合素α2、α3在小鼠肾发育过程中的时空性表达,探讨其与肾发育的关系。方法:应用免疫组织化学、图像分析、体视学及免疫印迹技术对不同胚龄及生后日龄小鼠肾组织中整合素α2、α3表达进行定位观察、定性分析和定量检测。结果:胚龄12 d整合素α2、α3即开始表达,整合素α2在肾小体表达微弱,在肾小管和集合管表达较强;整合素α3在发育各个时期肾小体都有较强表达,在肾小管偶见微弱表达。图像分析、体视学及免疫印迹检测结果显示它们的含量都随着肾的发育逐渐增加。结论:整合素α2、α3在小鼠肾发育中起一定作用,α2主要与肾小管和集合管发育相关,α3主要与肾小体发育相关。

整合素连接激酶和α-平滑肌肌动蛋白的表达与肾间质纤维化关系的研究

目的探讨整合素连接激酶(ILK)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)与肾间质纤维化(RIF)的关系。方法选取原发性肾小球肾炎患者肾活检标本88例,根据光镜下肾小管间质的病变程度分组。采用免疫组化方法检测各组标本ILK、α-SMA的表达,并将ILK、α-SMA的表达与肾间质纤维化程度进行相关性分析。结果ILK主要表达于病变肾小管上皮细胞,并且随肾间质病变的加重表达量增加,范围增大。肾小管间质中ILK表达量与RIF病变程度呈正相关;α-SMA表达主要见于纤维化间质,其表达与RIF程度呈正相关。结论随着肾小管间质病变程度的加重,ILK、α-SMA的表达逐渐增加,ILK可能参与了RIF的进程。

胶原相关整合素对人巩膜成纤维细胞增殖和胶原合成的影响

目的观察胶原相关整合素对人巩膜成纤维细胞增殖和胶原合成的影响。方法首先进行人巩膜成纤维细胞原代培养与鉴定,RT-PCR检测胶原相关整合素α1、α2、β1亚单位mRNA表达,Western blot法检测胶原相关整合素α1、α2、β1亚单位蛋白表达,CCK-8检测胶原相关整合素α1β1和α2β1对人巩膜成纤维细胞增殖的影响,实时荧光定量PCR检测胶原相关整合素α1β1和α2β1对人巩膜成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA表达水平的影响。结果成功进行了人巩膜成纤维细胞的原代培养。人巩膜成纤维细胞存在胶原相关整合素α1、α2、β1亚单位mRNA及蛋白水平的表达。胶原相关整合素α1β11mg·L-1和4mg·L-1抗体组细胞存活率分别为(86.3±4.5)%和(74.3±6.8)%,与对照组的100%相比,细胞存活率均显著下降,差异均有统计学意义(均为P<0.05),且呈浓度依赖性的抑制作用。胶原相关整合素α2β1抗体在1mg·L-1时有抑制作用,细胞存活率为(89.3±12.1)%,但与对照组的100%相比差异无统计学意义(P>0.05),4mg·L-1抗体组细胞存活率下降为(74.5±6.6)%,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。胶原相关整合素α1β1(4mg·L-1)抗体组Ⅰ型胶原mRNA表达明显减低,是对照组的0.48倍(P<0.05)。胶原相关整合素α2β1抗体1mg·L-1组和4mg·L-1组Ⅰ型胶原mRNA表达分别是对照组的0.94倍和0.87倍,与对照组相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论人巩膜成纤维细胞存在胶原相关整合素α1、α2、β1亚单位的表达。胶原相关整合素α1β1和α2β1影响人巩膜成纤维细胞的增殖。胶原相关整合素α1β1参与人巩膜成纤维细胞胶原的合成。

活血利水法对兔外伤性玻璃体视网膜病变增殖膜上整合素β_1表达的影响

目的:探讨活血利水之散血明目片对外伤性增生性玻璃体视网膜病变(traumatic Proliferrative Vitreo-retinopathy,tPVR)增殖膜(ERM)中整合素β1表达的影响及防治PVR的作用机理。方法:将40只成年有色家兔随机抽取32只,造成外伤性PVR模型,随机分成活血利水组、活血化瘀组、利水明目组、模型组,另8只为空白组。连续灌胃30天后,观察眼底PVR分级情况,免疫组织化学方法检测整合素β1表达在各组的表现及病理组织学改变。结果:在活血利水组,ERM中整合素β1阳性程度低于模型组,差异具有显著性(P<0.01)。活血化瘀组与利水明目组也能降低整合素β1表达的阳性程度,与模型组相比有显著性意义(P<0.05)。活血利水组整合素β1阳性程度低于另两个治疗组,有显著性差异(P<0.05)。活血利水治疗组整合素β1阳性程度略高于空白组,有显著差异性(P<0.01)。结论:活血利水法是活血化瘀和利水明目两者作用的协同,能通过拮抗增殖膜中整合素β1表达的作用来抑制增殖细胞的过度增生,从而防治PVR形成和发展。

癌相关成纤维细胞中Gal-1表达通过integrin β1促进胃癌细胞侵袭的机制研究

目的研究癌相关成纤维细胞中Gal-1表达通过integrinβ1促进胃癌细胞侵袭的机制。方法高表达Gal-1的胃癌CAFs采用原代培养法,通过CAFs与胃癌细胞共培养、siRNA转染、抑制Gal-1/封闭integrinβ1表达、细胞侵袭能力实验、侵袭能力影响实验和IHC实验等技术,研究胃癌细胞侵袭迁移能力受胃癌CAFs中Gal-1表达的影响程度及作用机制。分析高表达Gal-1的CAFs对癌细胞迁移能力和侵袭能力的影响,比较Gal-1和integrinβ1免疫组化实验结果。结果 CAFs共培养使得胃癌细胞侵袭和迁移能力得到明显提升,Gal-1的表达遭到siRNA抑制后,CAFs对迁移能力和侵袭能力的促进作用得到有效抑制。Gal-1主要在胃癌细胞的间质成纤维细胞中表达,integrinβ1主要在胃癌细胞的细胞膜中表达。Gal-1和integrinβ1在胃癌中的阳性率分别为56.67%(51/90)、43.33%(39/90),并且其表达与淋巴结转移、远处转移、TNM分期差异具有统计学意义(P<0.05)。结论CAFs表达Gal-1并通过促进胃癌细胞integrinβ1表达的形式提高胃癌细胞的侵袭迁移能力,指明今后胃癌的治疗和相关预后的研究方向,表现出一定的理论研究价值。

ILK-siRNA抑制衰老大鼠系膜细胞纤维连接蛋白积聚的研究

目的观察整合素连接激酶(integrin linked k inase,ILK)小干扰RNA(small interference,siRNA)对衰老大鼠系膜细胞细胞外基质纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的影响,探讨ILK在衰老肾脏肾小球硬化中的作用。方法分离培养3月龄和24月龄雄性W istar大鼠原代肾小球系膜细胞(m esangial cells,MCs),脂质体转染抑制ILK表达的siRNA或无关siRNA(con siRNA)。利用RT-PCR、W estern b lot和免疫荧光结合激光共聚焦显微镜技术检测ILK和FN的表达情况。结果ILK-siRNA转染可抑制3月龄和24月龄大鼠系膜细胞ILK和FN的表达水平(P<0.05);对24月龄大鼠系膜细胞的抑制程度更显著(P<0.05),几乎使ILK和FN下降到正常青年大鼠系膜细胞的水平。结论通过RNA i技术抑制ILK的表达,可减轻衰老大鼠系膜细胞FN的积聚,为肾脏器官衰老的防治提供新的干预靶点。

层黏连蛋白及其受体整合素α_2在小鼠肾泌尿小管发育中的表达

目的观察细胞外基质层黏连蛋白(Ln)及其受体整合素α2在小鼠肾泌尿小管发育中的表达,探讨它们在泌尿小管发育过程中的作用。方法应用免疫组织化学、图像分析、体视学方法和蛋白印迹技术对不同胚龄及生后日龄小鼠肾泌尿小管中的层黏连蛋白和整合素α2的表达进行系统观察和分析。结果层黏连蛋白表达于各期肾小管和集合管的基膜。整合素α2在各期肾小管和集合管的上皮细胞均有一定程度的表达。随着肾的发育,Ln和整合素α2的表达量逐渐增加。结论层黏连蛋白和整合素α2在泌尿小管的发育和成熟过程中一直发挥着作用,影响基膜的发育及上皮细胞极性的形成。

小鼠肾发育中整合素α_2、α_3及α_5的表达

目的:观察细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)受体-整合素α2、α3及α5在小鼠肾发育过程中的时空性表达,探讨其与肾发育的关系。方法:应用免疫组织技术结合体视学方法对不同胚龄及生后日龄小鼠肾组织中的整合素α2、α3及α5的表达进行系统观察和定量分析。结果:从胚龄12d整合素α2、α3及α5即开始表达;整合素α2在发育各期肾小体表达较弱,在肾小管和集合管表达较强;整合素α3在发育各期肾小体表达较强。体视学分析结果显示它们的含量均随肾的发育逐渐增加。结论:推测整合素α2、α3及α5在小鼠肾发育中起一定作用,α2主要与肾小管和集合管发育相关,α3与肾小体发育相关最密切。

体外鉴定汉坦病毒包膜糖蛋白G2与β3整合素的相互作用

根据汉坦病毒76-118株M基因和β3整合素基因序列设计引物,分别以质粒M56和Hela细胞cDNA为模板通过PCR扩增和基因重组获得G2蛋白膜外区81～140片段的GST融合表达质粒以及β3整合素膜外区23～133片段FLAG融合表达质粒。通过SDS-PAGE检测G2片段在BL21表达菌中诱导表达及纯化的效果,Western blot检测β3整合素片段在真核细胞中的表达。将在BL21裂解上清中表达的G2蛋白N端81～140位氨基酸片段(G2N81～140)纯化后与经过GST蛋白预处理的含有β3整合素片段的细胞裂解上清进行孵育,同时以未做任何转染的HEK293细胞裂解上清和无关蛋白GST-TLM作为阴性对照,通过GSTPull-down验证G2蛋白与β3整合素之间的相互作用。结果显示在Pull-down所获蛋白复合物中检测到β3整合素27～133位氨基酸片段产物的存在。结果表明G2蛋白与β3整合素之间可能存在有直接的相互作用,为β3整合素作为汉坦病毒细胞膜受体提供了进一步证据。

整合素连接激酶过表达促进猪骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的探讨提高骨髓间充质干细胞(BMMSC)向心肌样细胞分化的方法,观察整合素连接激酶(ILK)过表达促进BMMSC向心肌样细胞分化的效果。方法用包含人野生型ILK c DNA和绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒载体(Ad-GFP-ILK)转染体外培养的猪BMMSC,诱导其在BMMSC中高表达,并用高浓度(50μmol/L)的5-氮杂胞苷(5-AZA)刺激诱导BMMSC向心肌样细胞分化。实验分为空白对照组(N组)、Ad-GFP转染组(Ad组)、5-AZA诱导组(5-AZA组)、Ad-GFP-ILK转染组(ILK组)。用噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞活力;培养至2周、4周时采用免疫细胞化学染色检测心肌肌钙蛋白I(c Tn I)和α辅肌动蛋白(α-actinin)表达;4周时提取蛋白,Werstern blot检测c Tn I、缝隙连接蛋白43(CX-43)、Caspase-3和ILK的表达。结果 MTT检测结果显示Ad组、5-AZA组比N组、ILK组细胞活力明显减弱(P<0.05);但Ad组、5-AZA组之间,N组、ILK组之间比较均无统计学差异(P>0.05)。细胞培养至2周时,免疫细胞化学染色显示,5-AZA组、ILK组开始表达心肌特异性标记物c Tn I和α-actinin,而N组、Ad组均没有明显阳性表达。Western blot结果显示ILK蛋白在ILK组表达较其他组明显升高(P<0.05)。与N组、Ad组比较,5-AZA组、ILK组c Tn I表达明显升高(P<0.05);而5-AZA组、ILK组之间,N组、Ad组之间则没有差异(P>0.05)。CX-43在4组间的表达趋势与c Tn I相同。Caspase-3表达在Ad组、5-AZA组较其他组明显升高(P<0.05)。结论 ILK过表达能促进BMMSC向心肌样细胞分化,其分化效率和较高浓度的5-AZA体外刺激无差异。ILK过表达对细胞增殖活力无影响,且有一定的抗凋亡作用。

KAI1/CD82与整合素α3β1蛋白在子宫内膜腺癌组织中的表达及临床意义

目的检测KAI1/CD82、整合素α3β1蛋白在子宫内膜腺癌组织中的表达及与临床病理参数之间的关系。方法采用免疫组化的方法检测43例子宫内膜腺癌组织中KAI1/CD82及整合素α381蛋白的表达,选择13例子宫内膜不典型增生组织和14例正常子宫内膜组织作为对照。结果①子宫内膜腺癌组织中KAI1/CD82蛋白的阳性表达率为25.6%,明显低于不典型增生组的53.8%和子宫内膜组的85.7%,P<0.05;与手术-病理分期、细胞分化程度、淋巴结转移均密切相关,P均<0.05;②子宫内膜腺癌组织中整合素α3β1蛋白的阳性表达率为30.2%,明显低于不典型增生组的69.2%和子宫内膜组的78.6%,P<0.05;与肿瘤细胞的分化程度、淋巴结转移有关,P<0.05;③KAI1/CD82与整合素α3β1的表达有相关性(P<0.05)。结论KAI1/CD82、整合素α3β1的异常表达是子宫内膜癌浸润转移的重要分子学改变,两者可能形成复合物共同对内膜癌的浸润和转移发挥抑制作用;同时检测两者可作为临床预测和评估其浸润及转移的重要参考指标。

瘢痕成纤维细胞中TGF-β受体与整合素相互作用的实验研究

目的:了解TGF-β受体和整合素在瘢痕增生和挛缩过程中的作用。方法:通过荧光定量PCR法(FQ-PCR)测定经TGF-β受体、整合素和粘着斑激酶(FAK)抗体阻断后培养的瘢痕成纤维细胞TGF-β受体以及整合素表达量的变化。结果:经不同抗体阻断后培养的瘢痕成纤维细胞其TGF-βRI和整合素β1的基因拷贝数均较阴性对照组有不同程度的下降(P<0.05)。结论:TGF-β受体和整合素介导的信号传导途径间可能存在着正反馈的效应,共同促进瘢痕的增生和挛缩。FAK是两条信号传导途径的交汇点和作用的中心环节。

银屑病皮肤间充质干细胞可通过αvβ3整合素受体调节内皮细胞功能

目的探究银屑病皮损来源的真皮间充质干细胞(DMSCs)对内皮细胞功能的影响,探讨内皮细胞表面整合素受体αvβ3及其信号通路是否参与其中。方法通过DMSCs与脐静脉内皮细胞(HUVECs)在Transwell小室共培养的方式,检测共培养后HUVECs的增殖、黏附、迁移和体外成血管能力,同时通过实时定量聚合酶链反应(PCR)检测αvβ3和局部黏着斑激酶(FAK)的mRNA表达水平,通过蛋白质印迹法检测αvβ3、FAK和磷酸化FAK的表达水平。结果与健康对照组相比银屑病皮损来源DMSCs促进了HUVECs的增殖、黏附、迁移和体外成血管能力(0.43±0.03与0.59±0.03;190±13与250±15;40±7与105±6;1.32±0.22与4.60±1.00,均P<0.05),也上调了整合素αvβ3和FAK的mRNA及蛋白表达(均P<0.05),而且磷酸化FAK蛋白表达水平也显著升高(P<0.05)。结论银屑病皮损来源DMSCs能够通过分泌可溶性细胞因子改变局部微环境,影响内皮细胞功能,促进血管新生,参与银屑病的发病。在银屑病皮损DMSCs作用下与内皮功能相关整合素αvβ3及其下游FAK表达水平上调,表明银屑病皮损来源DMSCs可通过整合素αvβ3信号通路调节内皮细胞功能。

汉坦病毒包膜糖蛋白G2与β3整合素的表达及相互作用

目的研究汉坦病毒76-118株包膜糖蛋白G2与β3整合素之间的相互作用。方法根据HV76-118株M基因和β3整合素基因序列设计引物,分别以质粒M56和Hela细胞cDNA为模板通过PCR和基因重组获得带有EGFP标签的G2和带有FLAG标签的β3整合素膜外区片段融合表达质粒,并且在HEK293细胞中进行表达。将表达成功的G2与β3整合素片段进行免疫共沉淀,用Western blot检测它们之间的相互作用。结果成功构建了G2和β3整合素膜外区各片段的融合表达质粒。将各表达质粒转染HEK293细胞进行瞬时表达,Western blot结果显示β3整合素膜外区各功能片段在细胞裂解上清中获得大量表达,而G2蛋白膜外区仅有81-140片段在细胞裂解上清中大量表达。将G2 81-140片段与β3整合素膜外区各功能片段进行免疫共沉淀的结果显示,仅G2 81-140片段和β3整合素27-133片段在细胞中以复合物存在,提示两者之间可能有直接的相互作用。结论汉坦病毒76-118株包膜糖蛋白G2 81-140片段与β3整合素27-133片段在细胞中以复合物的形式存在,两者之间存在着相互作用,为β3整合素作为汉坦病毒受体提供了进一步的证据。

整合素α_2和α_3在小鼠肾脏发育过程中的表达

目的了解整合素α2和α3在小鼠肾脏发生发育过程中的表达规律及其与肾脏发生、发育及成熟的关系。方法应用免疫组化链霉菌素亲和生物素—过氧化物酶连接法(SP)测定不同胚龄及生后日龄小鼠肾组织中整合素α2和α3的表达。结果免疫组化结果显示整合素α2在生肾区及间充质表达;在未成熟肾小球有一过性的表达,在成熟肾小球没有表达;在发育各个时期的肾小管都有表达。整合素α3在肾小球、肾小管有表达,而在肾间质无表达。结论整合素α2主要在发育各个时期的肾小管表达,提示整合素α2对胚胎肾发育的诱导主要在肾小管。整合素α3在胚胎时期和成熟肾组织的主要作用是与肾小球的发育和成熟有关,而与小管发育成熟的关系相对来说较弱。