甘草提取物体外选择性诱导几种人肿瘤细胞凋亡

目的:从体外诱导人肿瘤细胞凋亡的角度研究传统中药甘草的抗癌作用。方法:采用Hoechst33342染色观察染色体凝聚和流式细胞仪检测凋亡峰两种方法检测细胞凋亡。分别以Fluo3和Rh123为荧光探针,用流式细胞仪测定胞内游离钙和线粒体膜电位△Ψm变化。用免疫组化方法检测原癌基因cfos、cjun与cmyc表达量的变化。结果:甘草选择性诱导胃癌MGC803、肝癌HepG2、肺癌NSCLC与宫颈癌Hela等几种人肿瘤细胞凋亡。甘草处理的MGC803、HepG2和NSCLC细胞均观察到胞内游离钙升高和△Ψm的下降。有趣的是,甘草不能诱导胃癌BGC823细胞凋亡,但其胞内钙和△Ψm与凋亡细胞株具有同样变化规律。原癌基因cfos、cjun与cmyc的蛋白产物在甘草处理的MGC803细胞中明显上调。结论:甘草抗癌活性与诱导肿瘤细胞凋亡有关,胞内钙升高、△Ψm下降和cfos、cjun与cmyc蛋白表达上调参与甘草诱导肿瘤细胞凋亡的调控。

加味逍遥散对肝癌细胞凋亡及钙离子的影响

目的观察加味逍遥散对离体肝癌SMMC-7721细胞生长的抑制作用及其对细胞内钙离子浓度的影响,探讨中药治疗肝癌的发病机制。方法采用MTT法测定高、中、低剂量加味逍遥散对肝癌SMMC-7721细胞生长的抑制作用;并利用流式细胞仪分析细胞凋亡情况;利用激光共聚焦显微镜观察细胞内游离钙离子情况。结果加味逍遥散对肝癌SMMC-7721细胞的生长有抑制作用,并且抑制率随着药物浓度的升高呈升高趋势;加味逍遥散高、中、低剂量组给药后凋亡率分别为0. 276、0. 202、0. 096;加入不同剂量的加味逍遥散时,钙离子荧光强度显示不同,低、中剂量时荧光增强不明显,而高剂量时细胞内荧光强度明显增强。结论加味逍遥散能抑制肿瘤细胞生长,促进细胞凋亡,同时能引起细胞内钙离子变化,这可能是加味逍遥散诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的机制之一。

心脉龙注射液对大鼠心肌细胞内游离Ca^(2+)的影响

目的探讨心脉龙注射液对大鼠心肌细胞内游离Ca2+的影响。方法采用荧光分光光度法测定给予不同剂量的心脉龙注射液后大鼠心肌细胞内Ca2+的浓度。结果心脉龙注射液3个剂量组(0.19、0.38、0.76g·L-1)均能增加心肌细胞内Ca2+含量,依次为169.18±11.64、233.26±10.69、164.25±10.34nmol·L-1,与对照组(120.64±3.02nmol·L-1)相比有显著性差异(P<0.01)。40μmol·L-1的维拉帕米对0.38g·L-1的心脉龙注射液所致的心肌细胞内Ca2+增加有抑制作用(抑制率为20%),而对0.19、0.76g·L-1心脉龙注射液所致的心肌细胞内Ca2+增加无明显抑制作用。结论心脉龙注射液强心作用与升高心肌细胞内Ca2+有关。

槲芪散及槲寄生提取物对肝癌细胞内游离钙离子浓度的影响

目的探讨方剂槲芪散及其君药槲寄生提取物多糖、总碱对人肝癌细胞HepG2生长的抑制作用及其对细胞内游离钙离子浓度的影响。方法采用MTT法测定槲芪散对细胞增生的抑制作用;利用流式细胞仪分析细胞周期、凋亡;利用激光共聚焦显微镜测定细胞内游离钙离子浓度。结果槲芪散及槲寄生提取物有较好的抑制肿瘤细胞增生的作用,高剂量组除了槲芪散和槲寄生总碱48 h时间点外,OA值均较对照组明显降低(P<0.001),呈现出时间-剂量依赖性;经药物作用48 h后,槲寄生多糖及总碱组G1期细胞比例增加,S期细胞和G2期细胞比例降低,槲芪散组G1期细胞比例无明显变化,S期比例降低,G2期比例增加,3者均使细胞凋亡增加;加入不同浓度的槲芪散、槲寄生多糖及总碱,低浓度时荧光增强不明显,而高浓度均导致细胞内荧光强度瞬间增强,升高到一定水平后,基本维持在一高水平,除槲寄生总碱组有略微下降外,其余2组未见明显下降趋势。结论槲芪散、槲寄生多糖及总碱均能抑制肿瘤细胞增生,促进细胞凋亡,且这3种药物引起胞内钙超载可能是诱导HepG2凋亡的机制之一。

β-淀粉样蛋白和载脂蛋白E4升高神经元胞内游离钙

目的 研究 β 淀粉样蛋白 (Aβ)和载脂蛋白E4(ApoE4)对神经元胞内游离Ca2 +浓度的影响 ,探索它们对神经元的毒性效应。方法 制备 0～ 3d新生SD大鼠的海马和皮层神经元悬液 ,负载上fura 2 /AM ,实验组分别加入Aβ2 5～ 3 5、ApoE4以及Aβ2 5～ 35+ApoE4孵育液温孵 3min后 ,用荧光双波长分光光度计测定神经元 [Ca2 +]i;采用显微准弹性激光散射技术 (MQLS) ,分析Aβ2 5～ 35及ApoE4对单个神经元散射光强度自相关函数 (ACF)的影响 ,通过公式由ACF拟合出反映细胞膜流动性的频移线宽Г。结果 Aβ2 5～ 35和ApoE4均能升高海马和皮层神经元静息 [Ca2 +]i(P <0 0 5 ) ,其中 5 μmol·L-1Aβ2 5～ 35的作用大于 1μmol·L-1Aβ2 5～ 3 5的作用 (P <0 0 5 ) ;Aβ2 5～ 35和ApoE4也能增强KCl去极化诱导的海马和皮层神经元 [Ca2 +]i 升高 (P <0 0 5 )。Aβ2 5～ 3 5(1μmol·L-1) +ApoE4(0 1μmol·L-1)共同作用也使神经元静息 [Ca2 +]i及KCl去极化诱导的神经元 [Ca2 +]i升高 (P <0 0 5 ) ,但两者共同作用未见其升 [Ca2 +]i 效应进一步增大。Aβ2 5～ 3 5和ApoE4均降低海马和皮层神经元的频移线宽Г。结论 Aβ2 5～ 35和ApoE4均能升高神经元静息[Ca2 +]i 及降低神经元膜流动性 ,但两者共同作用未能显示升

大黄酸抑制脂多糖刺激巨噬细胞升高[Ca^(2+)]_i和释放TNFα的作用特征

以正常腹腔巨噬细胞(PMΦ)和脂多糖(Lipopolysacharide,LPS)刺激的PMΦ为对象,用MTT法和激光共焦扫描显微术检测肿瘤坏死因子α(TNFα)释放量和单细胞[Ca2+]i的动态变化,研究了大黄酸(Rhein)的作用特征和机理.结果显示,大黄酸对正常PMΦ释放TNFα没有明确的影响,但对LPS刺激的PMΦ释放TNFα有显著的抑制作用,其抑制作用随浓度增加而增强,10-4mol/L大黄酸抑制了10μg/mL LPS效应的72％.值得注意的是,大黄酸不但抑制了LPS引发的PMΦ[Ca2+]i的升高,而且使LPS引发的[Ca2+]i由宽平台峰状转变为振荡动力学模式,胞外介质无钙时又转变为更低幅值的峰.以上结果表明,大黄酸降低LPS引发的PMΦ的[Ca2+]i升高是其抑制TNFα释放的信号传导通路的重要环节,并提示大黄酸在降低胞内钙释放和胞外钙内流的同时又对其动力学进行了类周期性的调制.

尼氟灭酸对急性低氧人肺动脉收缩的影响

目的研究钙激活氯离子(ClCa)通道阻滞剂尼氟灭酸(NFA)对急性低氧人肺动脉收缩的影响。方法在常氧(37℃、5%CO2、21%O2、74%N2)和急性低氧(37℃、5%CO2、2%O2、93%N2)条件下,采用荧光分光光度计法、离体血管灌流法,观察ClCa阻滞剂NFA和indaryloxyacetic acid(IAA-94)对急性低氧人肺动脉平滑肌细胞质内游离钙离子浓度([Ca2+]i)及肺动脉张力的影响。结果①急性低氧引起[Ca2+]i升高,由常氧时的(103.26±4.72)nmol.L-1升高至(253.89±9.82)nmol.L-1(P<0.01);加入NFA、IAA-94使[Ca2+]i明显下降,最低至(107.18±14.99)nmol.L-1(P<0.01);②急性低氧引起肺动脉环收缩,由常氧时的(4.54±0.52)g.g-1至最大收缩张力(49.51±1.30)g.g-1(P<0.01);加入NFA和IAA-94后,它们均能抑制由低氧引起的血管收缩,使收缩张力最低降至(4.50±0.40)g.g-1(P<0.01)。结论 NFA能有效抑制急性低氧引起的肺动脉收缩,这一效果可能是通过抑制ClCa通道活性来实现的。

人参皂甙对兴奋毒损伤的保护作用研究

目的 探讨人参皂甙对兴奋毒损伤神经细胞的保护作用。方法 应用在体外建立的谷氨酸对原代培养海马神经细胞兴奋毒的损伤模型和Fura - 2 /AM检测海马神经细胞胞内游离Ca2 + 浓度的方法 ,来探讨人参皂甙对兴奋毒损伤的保护作用及其作用机制。结果 人参皂甙可明显降低谷氨酸引起神经细胞乳酸脱氢酶泄漏率的升高 (P <0 .0 1) ,可以选择性降低大剂量谷氨酸引起的神经细胞胞内Ca2 + 浓度异常升高 (P <0 .0 1)。结论 人参皂甙可通过降低神经细胞胞内Ca2 + 浓度来对抗谷氨酸的神经性兴奋毒作用 ,进而保护神经细胞。

3,4-二氯苯丙烯酰另丁胺对分离的神经细胞内游离钙离子的影响

目的：研究新的桂皮酰胺类化合物３，４二氯苯丙烯酰另丁胺（简称ＡＥＤ８８０１）对分离的神经细胞内游离钙离子的影响。方法：采用Ｃａ２＋指示剂Ｆｕｒａ２作为细胞内钙离子的荧光探针，利用ＲＦ－５０００型双波长荧光分光光度计检测分离的神经细胞内游离钙离子及其变化，并观测ＡＥＤ８８０１对静息态细胞内钙离子、高Ｋ＋去极化状态及ＮＭＤＡ刺激情况下的细胞内钙离子变化的影响。结果：在静息状态下，细胞内钙离子浓度［Ｃａ２＋］ｉ为（２０６．５±１１．２）μｍｏｌ·Ｌ－１，高Ｋ＋去极化及ＮＭＤＡ刺激后［Ｃａ２＋］ｉ均增加。ＡＥＤ８８０１０和１００μｍｏｌ·Ｌ－１可以轻度降低静息态［Ｃａ２＋］ｉ，但无统计学意义（Ｐ＞０．０５），对高Ｋ＋去极化引起的［Ｃａ２＋］ｉ增加无明显的影响（Ｐ＞０．０５），而可降低由于ＮＭＤＡ引起的［Ｃａ２＋］ｉ增加，以１０μｍｏｌ·Ｌ－１和１００μｍｏｌ·Ｌ－１作用明显，与对照组比较Ｐ＜０．０５和Ｐ＜０．０１。结论：ＡＥＤ８８０１对电压依赖性的离子通道无明显的影响。

陡脉冲电场对体外人肝癌细胞内钙离子浓度的影响

为研究陡脉冲电场的凋亡效应,以人肝癌细胞系为实验对象,采用激光扫描共聚焦显微镜观察陡脉冲电场作用下细胞内钙离子浓度的变化,采用流式细胞术Annexin V检测陡脉冲电场诱导细胞凋亡。结果发现,陡脉冲电场能使肝癌细胞内钙离子浓度发生变化,变化的程度与陡脉冲电场的参数和胞外是否有钙有关,使得细胞内钙离子浓度稳态失调或大幅度振荡;流式细胞检测结果证实了陡脉冲电场能有效诱导肝癌细胞凋亡(与对照组比较,P<0.01),并且较低的电压峰值、较宽的脉冲宽度(200V/1.3μs)比较高的电压峰值、较窄的脉冲宽度(600V/100ns)能更有效地(P<0.01)诱导肝癌细胞凋亡。实验结果为陡脉冲杀伤肿瘤细胞的机制和参数选择提供了依据。

兴奋毒损伤海马神经细胞机制的研究

目的 探讨谷氨酸 (Glutamicacid ,Glu)的神经性兴奋毒损伤作用机制。方法 在体外快速剥离新生大鼠 (0 1天 )双侧海马 ,制成海马神经细胞悬液 ,用Fura 2 /AM负载 ,建立了Fura 2 /AM检测海马神经细胞胞内游离钙离子浓度 ([Ca2 + ]i)的方法 ,并检测Glu兴奋毒对海马神经细胞 [Ca2 + ]i的影响。结果 Fura 2单细胞检测表明 ,静息状态下海马神经细胞 [Ca2 + ]i=2 5 2 .6± 36 .1(nmol/L) ,Glu可使海马神经细胞 [Ca2 + ]i明显升高。大剂量Glu可使 [Ca2 + ]i升高几倍。结论 Glu导致神经细胞损伤的原因与细胞 [Ca2 + ]i超载有关。

神经生长因子对新生大鼠脑细胞内游离钙浓度的影响

目的观察神经生长因子(NGF)对分离的新生大鼠脑细胞内游离钙浓度([Ca2 + ]i)的影响。方法以Fura -2/AM为细胞内钙离子的荧光指示剂 ,测定谷氨酸(Glu)及过氧化氢(H2O2)诱导的新生大鼠脑细胞内[Ca2 + ]i,观察NGF对此影响。结果新生大鼠脑细胞内静息[Ca2 + ]i208±22nmol/L,NGF对神经细胞静息[Ca2 +]i无明显影响 ,NGF1～100μg/L能剂量依赖地抑制Glu和H2O2 引起的[Ca2 + ] i升高 ,其IC50 分别为42 5和27 3μg/L。结论NGF通过降低[Ca2 +

血管紧张素Ⅱ对血管内皮细胞内[Ca^(2+)]i和线粒体膜电位的影响及辛伐他汀的保护作用

目的观察血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)对血管内皮细胞内[Ca2+]i和线粒体膜电位的影响及辛伐他汀的保护作用。方法将血管内皮细胞分为空白对照组(仅给予细胞培养液)、单纯AngⅡ组(细胞培养液中加入AngⅡ,使其终浓度为10-7mol/L)、AngⅡ+小剂量辛伐他汀组(在单纯AngⅡ组的基础上加入辛伐他汀,使辛伐他汀的终浓度为0.2μmol/L)、AngⅡ+大剂量辛伐他汀组(在单纯AngⅡ组的基础上加入辛伐他汀,使辛伐他汀的终浓度为2μmol/L),用激光共聚焦显微镜测量各组细胞的[Ca2+]i和线粒体膜电位水平。结果①AngⅡ组的线粒体膜电位显著低于空白对照组(P<0.01);AngⅡ+辛伐他汀组的线粒体膜电位显著高于AngⅡ组(P<0.01);AngⅡ+大剂量辛伐他汀组的线粒体膜电位水平高于AngⅡ+小剂量辛伐他汀组(P<0.05)。②AngⅡ组的[Ca2+]i显著高于空白对照组(P<0.01);AngⅡ+辛伐他汀组的[Ca2+]i显著低于AngⅡ组(P<0.01);AngⅡ+大剂量辛伐他汀组的[Ca2+]i低于AngⅡ+小剂量辛伐他汀组(P<0.05)。结论AngⅡ可引起血管内皮细胞内[Ca2+]i的显著增高及线粒体膜电位的显著降低,而辛伐他汀可逆转AngⅡ的这一作用。

D-AP5 blocks the increase of intracellular free Ca^(2+) induced by glutamate in isolated cochlear IHCs

Objective To investigate the effect of D-AP5 (D-2-amino-5-phosphonopentanoate, a specific NMDA-antagonist) on the increase of intracellular free Ca 2+ concentration ([Ca 2+ ] i) induced by glutamate in isolated cochlear inner hair cells (IHCs), and to detect the autoreceptors of the IHC membrane. Methods When a laser scanning confocal microscope (LSCM) was used, the exogenous glutamate (Glu)-induced changes in [Ca 2+ ] i of isolated IHCs and OHCs of guinea pig cochlea were observed with fluo-3, a fluorescent probe for [Ca 2+ ] i. After D-AP5 or CNQX (6--cyano--7--nitroguinoxaline--2, 3--dione, a specific AMPA- antagonist) was administrated, the exogenous glutamate (Glu)-induced changes in [Ca 2+ ] i of isolated IHCs were recorded. Results In the presence of a low concentration Glu (3.85?μmol/L), there was an increase of [Ca 2+ ] i in IHCs, whereas there was no change in OHCs. When 50?μmol/L of D-AP5 was administrated in advance, Glu did not induce a corresponding increase in [Ca 2+ ] i in IHCs, and 50?μmol/L of CNQX did not completely block the increase of [Ca 2+ ] i in IHCs. Conclusions These results suggest that the autoreceptors existing in the IHC membrane are mainly of NMDA type, while there are relatively few AMPA receptors. Exogenous Glu is capable of increasing [Ca 2+ ] i in IHCs by acting on the NMDA autoreceptor of IHCs in a positive feedback manner.

骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞前后基因方面及Ca^(2+)浓度变化的研究

目的观察骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)按照Woodbury经典诱导方案将其诱导分化为神经元样细胞前后基因方面及Ca2+浓度的变化。方法分离纯化SD大鼠MSCs进行传代培养,传至第5代时,按照Woodbury经典诱导方案进行诱导,采用免疫组化和Realtime PCR技术检测诱导前后GAP-43、NSE、NF和Nestin的蛋白和mRNA表达的变化,采用激光扫描共聚焦显微镜检测诱导前后细胞内游离钙离子浓度的变化。结果诱导后GAP-43、NSE、NF和Nestin蛋白表达水平均有增高(P<0.05),但GAP-43、NSE、NF和Nestin基因表达改变不显著(P>0.05),更换诱导液后,细胞内荧光强度逐渐增加,到100s达高峰值,其后逐渐减弱,但20 min时细胞荧光强度仍高于诱导前。结论 MSCs诱导分化为神经元样细胞后GAP-43、NSE、NF和Nestin蛋白表达水平均有增高,但基因表达改变不显著,说明Woodbury经典诱导方案可能为转录后水平即蛋白水平的调控,游离钙离子可能对诱导分化有促进作用。

谷氨酸、NMDA和吗啡对培养大鼠星形胶质细胞内钙振荡的影响

目的:研究谷氨酸、NMDA、吗啡对原代培养的大鼠星形胶质细胞的胞内钙信号的影响及受体作用机制。方法:利用LeicaAF6000活细胞工作站,检测谷氨酸、NMDA、吗啡分别灌流前后Fura-2/AM加载的星形胶质细胞内钙信号的动态变化,进一步观察分别阻断代谢性谷氨酸受体5(mGluR5)、NMDA受体(NMDA receptor,NMDAR)和阿片μ受体对诱导的胞内钙振荡的影响。结果:谷氨酸、NMDA、吗啡均可明显升高胞内游离钙的浓度([Ca2+]i),而将其相应受体拮抗后,星形胶质细胞[Ca2+]i升高的现象可以被显著抑制。结论:离体培养的星形胶质细胞膜上存在mGluR5、NMDAR和阿片μ受体,这些受体的激活可以升高星形胶质细胞的[Ca2+]i,且这些受体依赖的[Ca2+]i的调控机制可能是星形胶质细胞与神经元交互作用的重要途径之一。

丹参诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞中的钙离子检测

目的检测大鼠骨髓间充质干细胞经丹参注射液诱导分化的神经元样细胞内钙离子浓度，以期为骨髓间充质干细胞应用于神经系统疾病的治疗提供理论依据。方法从成年大鼠骨髓中获取骨髓间充质干细胞，体外扩增培养．经碱性成纤维生长因子预诱导后施加10mL／L丹参注射液于骨髓间充质干细胞培养液中。运用免疫荧光检测神经元特异性核蛋白（NeuN）在诱导后细胞与经新生大鼠海马获取的体外培养海马神经元中的表达。激光共聚焦技术检测诱导后的细胞内钙离子浓度，并与原代培养海马神经元内的钙离子浓度进行比较。结果大鼠骨髓间充质干细胞经碱性成纤维生长因子和丹参注射液处理后．可表达NeuN，并具有神经元样的表型。诱导分化的神经元样细胞内钙离子浓度为984．75±79．51，原代培养海马神经元内钙离子浓度为769．42 ±60．93．两者比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论丹参注射液诱导骨髓间充质干细胞分化的神经元样细胞具有神经元的某些特征。

6'-羟基爵床素A对HepG2细胞内质网应激及胞内Ca^(2+)的影响

目的:研究新型抗肿瘤药物6'-羟基爵床素A(6'-hydroxy justicidin A,JR6)对HepG2细胞的内质网应激及胞内钙离子浓度变化的影响及其意义。方法:HepG2细胞经过终浓度分别为0,0.615,2.45,9.8μmol.L-1的JR6处理24h后采用实时定量RT-PCR技术、蛋白印迹(Western blot)法检测细胞中X-盒结合蛋白1(XBP-1)mRNA,IRE1α(inositol-requiring enzyme-1α),GRP78/BiP(glucose regulated protein/BiP),及Bcl-2(B cell leukemia 2)蛋白表达量的变化。激光扫描共聚焦显微镜测JR6作用24h后细胞内静息钙浓度变化及IP3R钙泵抑制剂光溜海绵素C干预后JR6的作用变化。结果:IRE1,XBP-1mRNA,Bip,Bcl-2蛋白的表达量均与JR6剂量负相关。高剂量组的各蛋白表达量与空白组相比,均下降了40%左右。共聚焦显微镜观察结果显示JR6引起细胞内钙离子浓度升高了2倍左右;加入IP3R钙泵抑制剂后,JR6不能引起细胞内钙升高。结论:JR6通过内质网钙泵IP3R升高细胞内的钙浓度,破坏细胞内的钙稳态;同时引起了内质网应激,并抑制了未折叠蛋白反应的相关因子。