Notch1、P21^(WAF1)和Involucrin在鼻咽癌组织中的表达及意义

背景与目的:Notch1受体蛋白的异常表达常见于多种原发性肿瘤,但它与鼻咽癌的关系仍不清楚。本研究拟探讨鼻咽癌组织中Notch1受体蛋白、其下游蛋白P21WAF1和Involucrin蛋白的表达,以及它们与鼻咽癌分化程度的关系。方法:采用免疫组织化学SP法检测101例鼻咽癌组织和20例鼻咽慢性炎症组织中Notch1﹑P21WAF1和Involucrin蛋白的表达。结果:20例鼻咽慢性炎症组织中Notch1、P21WAF1和Involucrin蛋白表达率分别为100%(20/20)、90.0%(18/20)、100%(20/20);鼻咽癌组织中Notch1、P21WAF1和Involucrin蛋白的表达率分别为77.2%(78/101)、89.1%(90/101)和80.1%(81/101);三者在不同组织类型鼻咽癌组织中的表达均有显著差异,随着分化程度的下降表达明显减弱,分别为P=0.000,P=0.026和P=0.000;并且在角化性鳞状细胞癌、分化型非角化癌和未分化癌之间两两比较,表达均有显著差异,分别P<0.05;Notch1的表达水平分别与P21WAF1和Involucrin的表达水平正相关,P=0.002和P=0.001;而P21WAF1与Involucrin的表达水平无明显的相关。结论:鼻咽癌组织中Notch1、P21WAF1和Involucrin的表达与鼻咽癌细胞分化程度密切相关。

食管胃结合部腺癌生物信息学分析及Involucrin基因突变位点筛选

目的检测食管胃结合部腺癌(AEG)患者基因突变情况,分析内披蛋白(IVL)突变对肿瘤细胞生物学功能的影响。方法将22例山西地区食管胃结合部腺癌患者的癌组织和癌旁组织进行全外显子组测序,分析IVL的突变情况并筛选IVL突变位点;整理汇总TCGA数据库中食管癌IVL的突变情况,进行GO功能注释和KEGG富集分析。构建IVL过表达质粒,转染食管癌细胞系KYSE150,测定细胞的增殖和迁移能力。体外合成不同突变位点的IVL寡肽,通过体外活性测试分析寡肽与转谷氨酰胺酶1(TGase1)的结合能力。结果测序结果发现在食管胃结合部腺癌中IVL有5处突变;GO分析显示IVL突变与上皮细胞分化、细胞分化调控的活性等生物学过程有关;KEGG信号通路分析显示IVL突变与cAMP信号通路等途径有关。过表达IVL可抑制食管癌细胞的增殖和迁移能力(P<0.05)。突变型IVL寡肽与TGase1的结合能力弱于野生型寡肽(P<0.05)。结论IVL重复基序第7位氨基酸的突变减弱IVL与TGase1的结合,影响多种与肿瘤相关的生物学过程和信号通路。

组胺对人角质形成细胞增殖、凋亡和分化的影响

目的探讨组胺对体外培养人角质形成细胞(HKC)增殖、凋亡和分化的影响及其机制。方法采用MTT法和蓝染色法检测组胺对HKC体外生长的影响,流式细胞仪检测细胞周期和细胞早期凋亡,细胞DNA梯度降解法检测凋亡,激光扫描共聚焦显微镜结合钙荧光探针技术检测HKC胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i),SABC免疫细胞化学法检测HKC分化标志物角蛋白10(K10)及内披蛋白表达。结果高浓度组胺抑制HKC生长,以10-4mol/L抑制率最大(细胞存活率65.6%);低浓度组胺则促进HKC生长,以10-8mol/L作用显著(细胞存活率130.7%)。10-4mol/L组胺致HKCG0/G1期比例增高30.97%,S期比例减少73.81%,抑制G1/S期转换,并明显促进细胞凋亡,早期凋亡率18.64%明显高于对照组(5.60%,P<0.05)。10-4mol/L组胺使HKC[Ca2+]i上升58.9%,H2组胺受体拮抗剂西咪替丁则使[Ca2+]i下降24.5%。10-4mol/L组胺下调HKCK10及内披蛋白表达,但与对照组无显著性差异(P>0.05)。结论高浓度组胺阻抑HKC细胞周期进程、诱导[Ca2+]i增加及其显著的促凋亡作用可能是使HKC体外生长受抑的部分机制。在生理条件下,组胺可能具有调节表皮组织更新的作用;在炎症、损伤等病理条件下,大量的组胺可能抑制表皮的再生和KC的分化。

神经酰胺诱导培养角质形成细胞分化的实验研究

目的 : 观察神经酰胺对无血清培养角质形成细胞分化的影响。方法 : 选择两种神经酰胺(C2和C6 ) ,分别添加于无血清培养的角质形成细胞培养液中 ,并在添加后 0、3、6、12、2 4h分别回收总RNA ,用逆转录PCR(RT PCR)方法 ,检测角质形成细胞分化的特异性标记 :TGase1、IVL、KRT1、KRT10等mRNA表达情况。结果 : 神经酰胺添加后 ,C2 神经酰胺对TGase1mRNA、IVLmRNA表达在 12小时均明显上升 ,在 2 4小时分别升高达阴性对照的 5 .7倍和 5 .2倍 ;但C2 神经酰胺对KRT1mRNA和KRT10mRNA表达升高不明显。C6 神经酰胺对TGase1mRNA、IVLmRNA表达大致与C2 神经酰胺相似 ,只是2 4小时表达比C2 神经酰胺降低 ,分别为阴性对照的 3.3倍和 3.5倍 ;但C6 神经酰胺对KRT1mRNA和KRT10mRNA表达显著高于C2 神经酰胺 ,2 4小时分别高达 5 .4倍和 10倍。结论 : 神经酰胺能明显升高无血清培养的角质形成细胞对分化特异性标记蛋白mRNA的表达 ,诱导角质形成细胞的分化。

As_2O_3诱导KB和Tca8113细胞分化与包壳蛋白表达的关系

目的探讨As2O3对人口腔鳞癌KB和Tca8113细胞诱导分化的作用与包壳蛋白(involucrin)表达的关系。方法用免疫荧光技术观察As2O3诱导KB和Tca8113细胞分化前后包壳蛋白的表达和变化。结果包壳蛋白在As2O3对人口腔鳞癌KB和Tca8113细胞诱导分化后比其诱导分化前包壳蛋白表达增高。结论As2O3诱导口腔鳞癌分化可导致包壳蛋白表达增高,其作用机理尚不清楚。

大翅蓟属植物提取物对皮肤屏障功能损伤的修复作用探讨

目的观察大翅蓟属植物提取物对皮肤屏障相关蛋白的表达的影响,探讨其屏障修复作用。方法通过使用胶带黏贴的方法,对离体培养的皮肤造成皮肤屏障功能损伤模型,每隔2 d涂抹大翅蓟属植物提取物,7 d后评估损伤皮肤的淋巴上皮Kazal型相关抑制因子(Lympho-epithelial Kazal type related inhibitor,LEKTI),兜甲蛋白(Loricrin,LOR),内披蛋白(Involucrin,INV)丝聚合蛋白(Filaggrin,FLG)的表达情况。结果正常皮肤和受损皮肤的LEKTI,LOR,INV,FLG染色均有增强,受损皮肤增强更为明显。结论大翅蓟属植物提取物可以提高皮肤FLG、LOR、INV、LEKTI的表达,进而提高皮肤屏障功能。

板层鱼鳞病患者指甲内皮蛋白与TGase1酶的表达及其TGM1基因序列分析

目的观察板层鱼鳞病(LI)患者指甲转谷氨酰胺酶1(TGase 1)与内皮蛋白的表达变化,分析其TGM1基因序列。方法分别自8例LI患者(LI组)和8例健康人(C组)的指甲中提取总蛋白进行SDS-PAGE电泳,分别采用免疫印迹及斑点印迹法检测内皮蛋白和TGase 1。对LI组不同家系两个家族的2例患者血液进行TGM1基因序列分析。结果LI组指甲总蛋白SDS-PSGE电泳呈5条主带,即38、48、54、63、69 kDa,而C组仅呈现前4条主带。LI组内皮蛋白主要定位于63、69 kDa主带,C组内皮蛋白仅定位于63 kDa主带。两组内皮蛋白及TGase1的灰度值(GSM)相比,P均<0.05。2例LI患者TGM1基因序列第8、12、13外显子皆有错义的点突变。结论LI患者的指甲内皮蛋白过度表达、TGase 1低表达,TGM1基因序列异常。

他克莫司联合罗格列酮对TNF-α诱导的HaCaT细胞增殖分化的影响

目的：评价他克莫司联合罗格列酮对TNF-α诱导的HaCaT细胞体外增殖和分化的影响。方法：他克莫司（10／maol／L）和不同浓度罗格列酮单独及联合作用于TNF-α诱导的HaCaT细胞48h后，用CCK-8法测定细胞增殖，逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）检测增殖分化标志物角蛋白6及外皮蛋白mRNA的表达水平；结果：他克莫司和罗格列酮均可抑制TNF-α诱导的HaCaT细胞体外增殖，下调角蛋白6mRNA表达，上调外皮蛋白mRNA表达，且联合用药组的作用更强。各组细胞生长抑制率：他克莫司10μmaol／L组为（21．71±5．36）％，罗格列酮组10、20、40、80μmol／L组分别为（5．04±7．12）％、（12．56±6．93）％、（21．41±5．95）％和（39．17±8．03）％，联合1-4组分别为（27．60±6．68）％、（38．35±7．24）％、（48．60±8．40）％和（65．21±4．53）％。结论：他克莫司、罗格列酮单独或联合应用均可抑制TNF-α诱导的HaCaT细胞体外增殖，促进其分化。

内皮蛋白、兜甲蛋白及角蛋白2e在三种鱼鳞病表皮中的表达

目的比较角蛋白鱼鳞病(KPI)与寻常型鱼鳞病(IV)和板层状鱼鳞病(LI)内皮蛋白(involucrin)、兜甲蛋白(loricrin)及角蛋白2e(K2e)的表达是否存在差异,与角化过度程度不一是否存在一定关系。方法以正常人为对照组,利用免疫组化半定量分析检测KPI、IV、LI三组患者表皮involucrin、loricrin及K2e的表达,并进行统计学分析。结果involucrin阳性细胞PU值:IV组(0.221±0.012)高于正常对照(0.144±0.011),其次是LI(0.128±0.008),KPI(0.113±0.008)最低,差异有统计学意义(P<0.01)。loricrin阳性细胞PU值:IV组(0.251±0.011)高于正常对照(0.207±0.030),其次是LI(0.170±0.012),KPI组(0.152±0.009)最低,差异有统计学意义(P<0.01)。K2e阳性细胞PU值:IV(0.241±0.013)高于KPI(0.130±0.021),两者均高于正常对照(0.115±0.008)和LI(0.114±0.008),差异有统计学意义(P<0.01),而正常对照组与LI组无统计学差异(P>0.05)。结论KPI与IV、LI患者中involucrin、loricrin及K2e的表达存在统计学差异。IV角化程度最轻,KPI最为严重,与上述蛋白的代偿性增多差异可能存在一定关系。

低剂量5-氨基酮戊酸光动力疗法对HaCaT细胞皮肤屏障相关蛋白表达的影响

目的通过研究低剂量5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid,ALA)光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)对HaCaT细胞中皮肤屏障相关蛋白表达的影响,探讨低剂量光动力改善皮肤屏障功能的潜在机制。方法以0、0.01、0.05、0.1、0.5及1 mmol/L ALA孵育HaCaT细胞后分别予以0、0.5、1.85、3.72及10 J/cm^(2)的(635±3)nm红光照射,CCK-8检测细胞存活率,摸索低剂量ALA-PDT促进HaCaT细胞活力的最佳ALA浓度及照光能量参数。将细胞分为对照组、光照组、ALA组、低剂量PDT组,分别予以相应处理后,用实时荧光定量PCR、Western blot实验检测细胞中丝聚合蛋白(filaggrin,FLG)、内皮蛋白(involucrin,IVL)、水通道蛋白3(aquaporin 3,AQP3)、紧密连接蛋白-1(claudin-1,CLDN1)、闭锁蛋白(occludin,OCLN)mRNA及蛋白表达。结果不同ALA浓度及不同照光能量处理HaCaT细胞的结果显示,在0.1 mmol/L ALA及3.72 J/cm^(2)照光能量的条件下,细胞的活力最佳。以该低剂量ALA-PDT处理HaCaT细胞后,FLG、IVL、AQP3、CLDN1及OCLN mRNA的相对表达量分别为10.25±6.34、5.10±2.74、4.89±1.33、8.53±6.43、4.06±2.01,对照组为1.01±0.01、1.02±0.02、1.01±0.01、1.01±0.00、1.02±0.01,光照组为2.64±1.04、2.29±1.49、2.49±1.87、4.51±4.41、1.57±1.12,ALA组为3.03±2.35、1.78±0.90、1.55±1.13、3.72±5.88、1.39±0.89,其中低剂量PDT组中FLG及AQP3表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。Wes-tern blot显示低剂量PDT组HaCaT细胞中FLG、IVL、AQP3、CLDN1蛋白表达水平均明显高于对照组、光照组及ALA组(P<0.05),OCLN的表达在几组中差异无统计学意义(P>0.05)。结论0.1 mmol/L ALA联合3.72 J/cm^(2)的照光能量为低剂量ALA-PDT对HaCaT细胞的最适ALA浓度及照光能量;低剂量ALA-PDT可能通过提高部分皮肤屏障相关蛋白的表达起到改善皮肤屏障的作用。

缓激肽对人角质形成细胞增殖凋亡及分化影响的实验研究

目的观察缓激肽(BK)对体外培养的人角质形成细胞(HKC)增殖、凋亡和分化的影响并探讨其机制. 方法以1×10-4～1×10-9 mol/L BK作用于体外培养的HKC,采用噻唑蓝法、台盼蓝染色法观察到1×10-4 mol/L BK抑制作用最强,以此浓度BK进行余下实验.当HKC达对数生长期后,一部分加入1×10-4mol/L BK作为实验组,另一部分不加BK作为对照组,分别培养24、48 h后采用流式细胞仪检测细胞早期凋亡情况及细胞周期,用链霉亲和素-生物素复合物(SABC)免疫细胞化学法检测HKC分化标志物角蛋白10(K10)及内披蛋白的表达情况.用含1×10-4mol/L BK的无血清培养基KC-SFM培养HKC作为实验组,对照组细胞仅加KC-SFM,分别用激光扫描共聚焦显微镜结合钙荧光探针Fluo-3/AM 技术检测细胞内游离Ca2+浓度即[Ca2+]i的变化. 结果与对照组比较,实验组G0/G1期细胞比例相对上升34.57%,S期相对下降58.91%,其细胞早期凋亡率为15.34%,明显高于对照组(5.60%,P<0.05).实验组HKC K10阳性细胞百分比为2.20%,明显低于对照组(6.89%,P<0.05).BK作用3 min后实验组HKC [Ca2+]i较对照组上升163.0%,之后开始下降,5 min后接近对照组.结论高浓度BK可抑制HKC周期进程、明显促进其凋亡及诱导[Ca2+]i升高,这可能是其使HKC体外生长受抑的部分机制.BK还可抑制表皮再生和HKC分化.

基于自身免疫调节因子探讨左归丸对先天肾虚仔鼠T细胞迁移的影响

目的:观察左归丸对先天肾虚仔鼠胸腺和胸腺上皮细胞(TECs)内自身免疫调节因子(AIRE)、胰岛素样生长因子2(IGF2)、套膜蛋白(Involucrin)的表达和T细胞分类的影响。方法:构建先天肾虚仔鼠模型,各组孕鼠分别给予0.9%氯化钠溶液,胸腺肽,左归丸大、小剂量混悬液灌胃,至仔鼠出生。正常仔鼠胸腺TECs做原代培养,分为空白组、左归丸组、抑制剂组和抑制剂左归丸组。流式细胞学检测仔鼠胸腺和脾脏内T细胞分型,Western blot和RT-PCR检测胸腺和TECs内AIRE、IGF2、Involucrin蛋白和基因表达。结果:与对照组比较,模型组仔鼠脾脏内CD_4^(+)/CD_(8)^(+)T细胞,胸腺内AIRE、IGF2、Involucrin蛋白和基因表达均降低(P<0.05),胸腺内SP细胞增加(P<0.05);胸腺肽组及左归丸低、高剂量组仔鼠脾脏内CD_4^(+)/CD_(8)^(+)T细胞,胸腺内AIRE、IGF2、Involucrin蛋白和基因表达升高(P<0.05),胸腺内SP细胞减少(P<0.05)。与空白组比较,抑制剂组TECs内AIRE、IGF2、Involucrin蛋白和基因表达减少(P<0.05);与抑制剂组比较,左归丸组和抑制剂左归丸组TECs内AIRE、IGF2、Involucrin蛋白和基因的表达上升(P<0.05)。结论:先天肾虚仔鼠脾脏内CD_4^(+)/CD_(8)^(+)失衡,左归丸可以通过提高胸腺内AIRE、IGF2、Involucrin的表达,促进T细胞在胸腺正常成熟和外迁,纠正外周免疫器官脾脏的失衡状态。

人类磷酸泛酰巯基乙胺结合蛋白新基因的分离和鉴定

在对AD293和HEK293进行差减杂交以探索两者在吸附和凋亡特性上的差异时,从AD293的高表达文库中分离得到一段新的cDNA片段.从人类胎脑文库克隆得到该基因,全长2 745 bp,编码的蛋白含518个氨基酸,被预测为磷酸泛酰巯基乙胺结合蛋白.该基因在染色体上定位于2p22.3,包含8个外显子.该cDNA编码的蛋白序列含有一个凋亡抑制蛋白5结构域,外皮蛋白重复片段和铜结合辛肽重复片段.RT-PCR分析显示该基因在人类正常组织和癌组织中广泛表达,但在癌组织中表达量相对较低,提示其可能对细胞凋亡有抑制作用.该基因在进化过程中高度保守.

抗角蛋白16抗体对角质形成细胞外皮蛋白、Toll样受体2和4的调节

目的研究抗角蛋白16抗体对角质形成细胞分化、Toll样受体2和4的调节。方法将抗角蛋白16抗体加入培养的角质形成细胞中,以同种型抗体作对照,研究外皮蛋白和Toll样受体2和4 mRNA表达。结果抗角蛋白16抗体作用角质形成细胞6 h、24 h、36 h后,Toll样受体2mRNA表达分别上调1.73、1.60、2.52倍:12 h和36 h后Toll样受体4 mRNA表达分别上调3.62和2.21倍;12 h、36 h后外皮蛋白mRNA表达分别上调2.33倍和2.0倍。结论抗角蛋白16抗体可能是联系Toll样受体2和4与角质形成细胞分化的重要环节。