DMB衍生-高效液相色谱法测定重组人促卵泡激素中的唾液酸含量

目的建立采用4,5-亚甲二氧基-1,2-苯二胺二盐酸盐(DMB)衍生-高效液相色谱-荧光检测器(HPLCFLD)法(DMB衍生法)同时测定重组人促卵泡激素(rhFSH)中2种唾液酸组分N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)和N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)含量的方法。方法将DMB衍生法与邻苯二胺衍生-高效液相色谱法(邻苯二胺衍生法)进行对比研究,对DMB衍生法中的水解条件进行优化并确定最终方法为rhFSH原液经酸水解后,采用DMB进行衍生,经Agilent ZORBAX 300SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)分离,采用荧光检测器检测。结果与邻苯二胺衍生法相比,DMB衍生法能够实现Neu5Gc与Neu5Ac相关杂质的有效分离。该方法Neu5Gc和Neu5Ac分别在0.5~5.0μg·mL^(-1)(r=0.9999)和25~250μg·mL^(-1)(r=0.9998)浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系;Neu5Gc和Neu5Ac的检测限分别为11.07、10.30 ng·mL^(-1),定量限分别为33.21、20.60 ng·mL^(-1),两者回收率分别为(99.63±1.33)%(n=9)和(100.62±1.58)%(n=9),RSD分别为1.3%(n=9)和1.5%(n=9)。结论该方法专属性强、灵敏度高、精密度和准确度良好,可用于准确测定rhFSH中唾液酸Neu5Gc和Neu5Ac的含量。

高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法测定牛乳及制品中的唾液酸

建立了高效阴离子交换色谱分离-脉冲安培检测法检测常见唾液酸N-乙酰神经氨酸（Neu5AC）和N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）的方法,对影响分离和检测的条件进行了优化。以NaOH和NaAc为淋洗液,在CarboPac PA20阴离子交换柱上梯度分离,在30℃柱温,0.5 mL/min的流速下,20 min内可完成两种唾液酸的分析。使用脉冲安培检测法测定Neu5AC和Neu5Gc的线性范围为5-500μg/L;检出限为3.0和1.8μg/L（25.0μL进样,以3倍信噪比计算检出限）。将该方法用于15个牛乳及制品中Neu5AC和Neu5Gc的测定,两种唾液酸的标准加入回收率为88%-115%。方法具有灵敏、简便和环境友好的特点,样品前处理方法简单,方法适用性好。

高效液相色谱法测定母乳中唾液酸含量

建立荧光高效液相色谱(fluorescence detector-high performance liquid chromatography,HPLC-FLD)测定母乳中唾液酸N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)和N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolyl neuraminic acid,Neu5Gc)含量的分析方法。利用酸水解法释放出母乳中的唾液酸,以4,5-亚甲二氧基-1,2-邻苯二胺盐(4,5-methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride,DMB)为衍生化试剂,50℃避光衍生150min,采用荧光高效液相色谱仪检测。色谱条件:LiChrosorb RP-18柱(250mm×4mm,5μm),流动相为甲醇-乙腈-超纯水(7:8:85),流速0.9mL/min,进样体积10μL,柱温30℃,荧光检测器激发波长373nm,发射波长448nm。结果表明:唾液酸在50～400μmol/L范围内与唾液酸峰面积的线性关系良好,平均回收率为94.0%,精密度的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为0.4%,稳定性RSD为1.0%,重复性RSD为0.8%,Neu5Ac的最低检出限为0.02μmol/L,Neu5Gc的最低检出限位0.03μmol/L。该方法简单、重复性好、灵敏度高,可广泛用于奶粉、牛奶及母乳中唾液酸含量测定。

在线富集胶束电动色谱法测定唾液中的唾液酸

建立了1种测定唾液酸的在线富集胶束电动色谱法。首先研究了不同的表面活性剂 (十二烷基硫酸钠、胆酸钠和脱氧胆酸钠 )、背景电解质 (磷酸盐、硼砂和3_环己胺_1_丙烷磺酸 )、缓冲溶液的 pH值及有机修饰剂 (甲醇和乙腈 )的加入对测定唾液酸的影响 ;其次研究了样品基体的组成及进样时间对富集效果的影响 ;最后考察了所建立方法的线性、检出限和重复性 ,并将该方法成功地应用于测定人体唾液中的唾液酸 。

采用盐析及Q Sepharose FF分离纯化酪蛋白胃蛋白酶水解物中的酪蛋白糖巨肽

本文探讨了利用了(NH4)2SO4分级沉淀、透析脱盐及Q-SepharoseFF层析分离纯化酪蛋白的胃蛋白酶水解物中的CGMP的工艺。结果表明:采用60%饱和度的(NH4)2SO4盐析,可从上清液中直接回收高纯度CGMP,得率为0.71%。低饱和度的(NH4)2SO4可有效脱除杂蛋白。脱盐粗提物CGMPQ-SepharoseFF层析条件为:pH8.5、20mmol/LTris缓冲液平衡上样,用含0.3mol/LNaCl、20mmol、pH7.1的Tris缓冲液洗脱;浓缩物最大上样量为34.2mg蛋白/ml树脂。利用优化的工艺对水解液层析纯化,纯化产物得率约为2.19%(以酪蛋白计),总结合态唾液酸回收率为87.4%(以酶解液中的唾液酸计),糖基化度可提高到0.472以上。整个工艺路线简便、快捷、成本较低,适合工业化生产。

离子色谱-积分脉冲安培法测定燕窝中N-乙酰神经氨酸的含量

目的建立一种离子色谱-积分脉冲安培法测定燕窝、速食燕窝及银耳、海藻酸钠、鱼胶等常见伪品燕窝中N-乙酰神经氨酸的含量。方法采用DionexICS-5000离子色谱仪、DionexASRSRR5004-mm抑制器、电导检测器测定，色谱柱为CarbonPacPAI柱，柱温为30℃．流动相为100mmol／LNaOH＋50mmol／LNaAc，流速为1．0mL／min，进样量为10μL，分别测定燕窝、速食燕窝及伪品中N-乙酰神经氨酸的含量。结果N-乙酰神经氨酸在0．25～5．00μg/mL范围内线性良好，r=0．9999；在燕窝中的平均回收率为99．7％，RSD为0．82％（n=6）。结论本方法灵敏度高、重复性好，可准确测定燕窝中^L乙酰神经氨酸的含量，为燕窝的质量控制提供了一种检测方法。

高效液相色谱法测定牛奶中N-乙酰神经氨酸的含量

利用酸水解法把牛奶中的N-乙酰神经氨酸释放出来，以邻苯二氨盐酸盐为衍生化试剂，80℃水浴锅中衍生40min，采用Symmetry C18柱（250mm×4．6mm，5μm），流动相为1.0％的四氢呋喃水溶液（含0．2％磷酸）-乙腈（92：8），流速为1．0mL／min，柱温为35℃，紫外检测波长230nm，结果表明N-乙酰神经氨酸在10—320μg／mL范围内线性良好，平均回收率为96．5％．

唾液酸单体的HPLC测定及其在唾液酸纯化中的应用

建立了高效液相色谱法测定唾液酸单体的方法, 色谱柱为ZORBAX SB C18 柱, 流动相为pH 3的硫酸水溶液, 流速1.0 mL/min, 进样量5.0μL, 在波长210 nm处检测, 唾液酸单体质量浓度与峰面积呈良好的线性关系,相关系数为0.999 9。在唾液酸单体的纯化过程中用此方法进行检测; 与质谱分析相结合, 确立了聚唾液酸水解液中唾液酸二聚体的存在。

高效液相色谱法测定奶粉中唾液酸的含量

利用酸水解法可释放出奶粉中的蛋白结合态唾液酸,以邻苯二氨盐酸盐为衍生化试剂,80℃水浴中衍生40min,采用Symmetry C18柱(250 mm×4.6mm,5цm),流动相为1.0%的四氢呋喃水溶液(含0.2%磷酸)-乙腈(92:8),流速为1.0mL/min,紫外检测波长227nm。结果表明,唾液酸在质量浓度为20～500mg/L范围内线性良好,平均回收率为96.8%。该方法具有灵敏度高,重复性好等特点,可准确测定奶粉中唾液酸的质量浓度。

DMBA衍生/超高效液相色谱法测定鱼肉中唾液酸含量

建立了同时检测鱼肉中N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)和酮基-脱氧壬酮糖酸(KDN)3种核心唾液酸的超高效液相色谱-荧光检测(UPLC-FLD)方法。冷冻干燥后的样品在8 mL 0.6 mol/L盐酸溶液中80℃酸解20 min,采用4,5-二甲基-1,2-苯二胺(DMBA)衍生试剂进行衍生。前处理后的样品经Waters Acquity UPLC BEH C_(18)柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)分离,以纯水-乙腈为流动相梯度洗脱,荧光检测器检测。结果表明,Neu5Ac、Neu5Gc和KDN在0.02~5.0μg/mL范围内呈良好的线性关系(r^(2)>0.999),定量下限(S/N=10)分别为0.20、0.20、0.10μg/g;加标回收率为90.8%~103%,相对标准偏差(RSD)为2.8%~5.0%。该方法分析时间短,4 min内可完成3种唾液酸的分离,分离效果好,且方法灵敏度、准确度高,适用于鱼肉中唾液酸的测定。

大肠杆菌发酵液中唾液酸的提取

大肠肝菌发酵液经超滤和乙醇沉淀获得聚唾液酸粗品 ,在 80°C水浴、p H2的条件下水解 3h,中和、离心后 ,上清液用离子交换色谱分离纯化 ,冷冻干燥后得到唾液酸成品 ,纯度达 98.1%。

超高效液相色谱-串联四极杆质谱法分析婴儿乳粉中的唾液酸

建立了超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)测定婴儿配方乳粉中唾液酸含量的分析方法。利用酸水解方法释放出婴儿配方乳中的唾液酸,经HLB反相色谱固相萃取柱净化,采用BEH HILIC色谱柱分离,以0.1%甲酸水溶液和100%乙腈溶液作为流动相进行梯度洗脱,流速为0.25 mL/min,进样体积5μL,柱温30℃,电喷雾质谱检测,正离子多反应监测模式进行定性和定量分析。结果表明:唾液酸在0.05～5.0 mg/L范围内与唾液酸峰面积的线性关系良好(R2=0.998 9);以0.1、0.5、2.5和5.0 mg/L4个添加水平进行添加回收试验,唾液酸的平均回收率为84.3%～98.9%,相对标准偏差为4.9%～8.2%;唾液酸的检出限为0.01 mg/L。该方法简单、快速、重复性好、灵敏度高,可广泛用于奶粉、牛奶及母乳中唾液酸含量的分析测定。

聚唾液酸的水解与唾液酸的纯化

在HPLC分析唾液酸质量分数的基础上,选择盐酸作为大肠杆菌发酵液中聚唾液酸的水解用酸.在85℃水浴.盐酸浓度为0.1mol/L的条件下,水解2h,水解率平均可达95%以上.水解液中和过滤后,用离子交换色谱分离与冷冻干燥得到唾液酸产品.质谱及HPLC分析证实所得产品中主要成分是N 乙酰神经氨酸,其纯度达96.4%.

高效液相色谱法检测婴儿配方奶粉中唾液酸

建立一种用4,5-亚甲基二氧基-1,2-邻苯二胺盐(DMB)衍生的荧光高效液相色谱(HPLC-FLD)检测婴儿配方奶粉中唾液酸的方法,该方法首先酸水解,然后避光衍生后荧光高效液相色谱测定。用c18柱分离,流动相为甲醇∶乙腈∶超纯水=7∶8∶85,流速为1 mL/min,标准曲线法定量。结果表明:唾液酸在甲酸水解作用中从糖链、糖蛋白中释放出来,达到了最大的释放量;并在50℃,150 min条件下DMB避光衍生,达到反应的最大值,并且该方法具有良好的准确度和精密度,平均回收率为95.83%:,最低检出限为0.02μmol/L。

离子交换色谱对抗VEGFR2单抗的电荷异质性分析

目的采用离子交换高效液相色谱(CEX-HPLC)分析抗VEGFR2(抗血管内皮生长因子受体2)单抗制品的电荷异质性。方法应用CEX-HPLC技术,对VEGFR2单抗进行电荷异质性分析,并结合羧肽酶B(CpB)和N-糖酰胺酶F(EndoF2)酶切,初步研究其电荷异质性的成因。结果用CEX-HPLC分析CpB酶切前后单抗,证明其碱性变异体主要由C末端赖氨酸不均一性引起;分析EndoF2酶切前后处理的单抗,证明其酸性变异体部分由N-糖末端上的唾液酸修饰所引起。通过2种酶的顺序酶切可相对准确地分析含C-末端赖氨酸以及含唾液酸单抗的比例。结论采用CEX-HPLC可较好地分析单抗的电荷异质性;并结合合适的酶切处理,可判断单抗主要电荷异质性的来源,为保证单抗制品生产工艺的稳定性及质量控制提供了有效手段。

离心液相色谱法快速分离纯化神经节苷脂

神经节苷脂在脊椎动物的神经组织细胞膜上含量丰富，除有受体的功能外，还有许多其它功能。采用离心液相色谱法，以国产硅胶Ｇ－６０为填料，分离纯化神经节苷脂，取得了满意的效果。经分离后产物的脂结合唾液酸（ＬＢＳＡ）含量，由１４．３％提高到２４．１％。以蛋白质含量为代表的含氮化合物由２２．０％降至９．６％。回收率为９０．２５％。特点是操作简便、周期短、成本低、效果好。优于ｌａｔｒｏｂｅａｄｓ柱层析法。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏红细胞膜唾液酸含量的改变

目的 :测定葡萄糖 - 6 -磷酸脱氢酶 (G6PD)缺乏时红细胞膜唾液酸的含量 ,以进一步了解G6PD缺乏溶血的机理 .方法 :以G6PD缺乏红细胞为研究对象 ,按常规方法分离红细胞膜 ,酸水解得到膜唾液酸 .利用反相高效液相色谱 -荧光法测定G6PD缺乏红细胞膜唾液酸的含量 .结果 :G6PD缺乏红细胞膜唾液酸含量明显低于正常红细胞 ,P <0 0 1.结论 :随着膜脂质过氧化作用和非酶糖基化的发展 ,唾液酸含量下降 ,从而导致膜表面负电荷减少 ,红细胞聚集 ,诱导红细胞形成缗线状红细胞簇 ,变形能力下降 ,并且使膜糖蛋白和糖脂次末端的半乳糖残基暴露 ,红细胞易被巨噬细胞识别并吞噬 .因此 ,红细胞膜唾液酸含量下降 ,可能是G6PD缺乏红细胞溶血的原因之一 .

高效阴离子交换色谱-脉冲安培法测定母乳及婴儿配方粉中的唾液酸

该文建立了高效阴离子交换色谱-脉冲安培法检测母乳和婴儿配方粉中常见唾液酸N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)和N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolyl neuraminic acid,Neu5Gc)的方法。利用酸水解法释放母乳和婴儿配方粉中的唾液酸,用离子色谱前处理柱纯化婴儿配方粉水解液。采用Dionex CarboPac PA20高效阴离子色谱柱分离,以NaOH和乙酸钠为淋洗液进行梯度洗脱,流速0.5 mL/min,进样体积10μL,柱温30℃,脉冲安培检测器检测,优化了酸水解时间和婴儿配方粉纯化条件。所测2种组分在该实验条件下能够很好的分离,且在较宽的浓度范围内离子峰面积呈良好的线性关系(R^(2)>0.999)。Neu5Ac和Neu5Gc的检出限分别为3和2μg/L,定量限为10和6μg/L。母乳和婴儿配方粉的加标回收率在87.65%~102.33%,稳定性的相对标准偏差在1.86%~5.21%。该方法样品处理简单,具有较低的检出限与定量限,较宽的线性范围,较好的稳定性,良好的重复性与回收率,能广泛用于乳基唾液酸的检测。

液相色谱-串联质谱法检测人血浆及脂蛋白唾液酸的含量

建立了液相色谱-串联质谱（LC-MS / MS）检测人血浆脂蛋白唾液酸的方法，并比较了糖尿病患者与健康人血浆脂蛋白唾液酸的差异。采用 pH =2的醋酸水解唾液酸，高速离心后采用优化的条件进行 LC-MS / MS 分析。结果表明：在负离子模式下，唾液酸的检出限和定量限分别为7.4和24.5 pg。唾液酸在2.5-80 ng / mL 范围内呈良好的线性关系，相关系数 R2大于0.998。糖尿病患者（平均年龄51.6岁）和健康人（平均年龄50.7岁）血浆中唾液酸的含量分别为（548.3±88.9）和（415.3±55.5）mg / L；两组实验人群中极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白唾液酸的含量分别为（4.91±0.19）、（6.95±0.28）、（3.61±0.22）μg / mg和（2.90±0.27）、（7.03±0.04）、（2.40±0.09）μg / mg。糖尿病患者极低密度脂蛋白和高密度脂蛋白唾液酸含量显著高于同龄健康人水平（ P〈0.01）。该法可快速检测血浆中脂蛋白唾液酸含量，省时省力。

液相色谱法测定鹿茸中唾液酸含量

建立阳离子交换-液相色谱测定鹿茸中唾液酸含量的方法。确定用盐酸对试样进行水解处理。色谱条件:色谱柱为Zorbax300-SCX阳离子交换柱,流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液(90:10,V/V),流速1.0mL/min,进样量10.0μL,紫外检测波长205nm。结果表明,鹿茸中的唾液酸质量浓度在5～100μg/mL范围内与峰面积线性关系良好,最低检测限浓度(RSN=3)为0.60μg/mL,方法检出限为0.03g/kg,平均加样回收率为83.4%,RSD为4.9%(n=6)。此法适用于鹿茸及相关产品中唾液酸含量的检测。