金黄色葡萄球菌IsdB表位蛋白与HBc蛋白融合表达

目的:采用大肠杆菌表达HBc-IsdB50-285融合蛋白,探讨其在原核表达系统中的表达效果。方法:设计并克隆HBc-IsdB50-285融合基因片段,构建表达质粒pET-28-HBc-IsdB50-285,并转化入E.coli BL21,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。SDS-PAGE分析蛋白可溶性及相对分子质量;BCA法测蛋白浓度;采用免疫接种法检测重组蛋白的免疫活性。40只小鼠随机分为rIsdB+adjuvant组、HBc-IsdB50-285+adjuvant组、HBcIsdB50-285组和PBS组,每组10只,间接ELISA法检测小鼠特异性IgG效价值,采用金黄色葡萄球菌Newman株对免疫后小鼠攻毒,检测各组小鼠重组蛋白免疫保护效果。结果:表达质粒pET-28-HBc-IsdB50-285经测序及酶切鉴定证明构建正确;SDS-PAGE分析,重组蛋白以部分可溶形式存在于培养上清中,相对分子质量约为44 000,亲和纯化后蛋白质水平为1.0g·L-1。ELISA检测,使用rIsdB蛋白包被酶标板,HBc-IsdB50-285+adjuvan组小鼠血清特异性抗体滴度的效价值低于rIsdB+adjuvant组(P<0.01);使用HBc-IsdB50-285蛋白包被酶标板,HBc-IsdB50-285+adjuvant组的小鼠血清特异性抗体滴度的效价值高于rIsdB+adjuvant和HBc-IsdB50-285组。攻毒实验,HBc-IsdB50-285+adjuvant组小鼠对金黄色葡萄球菌免疫保护率低于rIsdB+adjuvant组,但差异无统计学意义(P>0.05);且其与HBc-IsdB50-285未添加佐剂组比较差异也无统计学意义(P>0.05);与PBS组比较,HBc-IsdB50-285+adjuvant组小鼠对金黄色葡萄球免疫保护率升高(P<0.01),HBc-IsdB50-285组小鼠对金黄色葡萄球菌攻毒保护率亦升高(P<0.05)。结论:HBc-IsdB50-285原核表达载体构建成功;在大肠杆菌中成功表达具有较好生物活性的HBc-IsdB50-285融合蛋白。

2种HBsAg定量检测系统对HBV不同感染阶段及不同基因型样本检测的一致性评价

目的分析罗氏MODULAR E170电化学发光免疫分析系统（简称罗氏E170）和雅培i2000化学发光微粒子免疫分析系统（简称雅培i2000）定量检测慢性乙型肝炎不同感染阶段、不同基因型患者的乙型肝炎表面抗原（HBs Ag）结果的一致性。方法收集临床未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者血清样本共125例,根据《慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）》中的标准,将样本分为免疫耐受期、免疫清除期、低复制期和再活动期4组,同时根据基因型（B/C）及HBs Ag水平（HBs Ag≤1 000 IU/m L/HBs Ag〉1 000 IU/m L）分组。用罗氏E170和雅培i2000 2种系统平行检测HBs Ag,分析各组间2种系统检测结果的一致性。结果 2种系统检测结果总体相关性、一致性好（r=0.989,P均〈0.001）;在4个不同感染阶段,2种系统检测结果的相关性好（r值为0.977~0.993,P均〈0.001）;在一致性分析中,免疫清除期、低复制期和再活动期样本检测结果的一致性较好,但在免疫耐受期罗氏E170检测结果较雅培i2000高,偏差为0.114 log IU/m L;B、C基因型组2种系统检测结果的相关性、一致性均好（r值均〉0.95,P均〈0.001）;在HBs Ag高水平组中,2种系统检测结果的r值为0.959（P〈0.001）,相关性较HBs Ag低水平组略差,但在专业可接受范围内;且在HBs Ag高水平组中,2种系统的偏差较大,罗氏E170检测结果比雅培i2000平均高0.076 log IU/m L。结论 2种系统检测不同感染阶段及不同基因型样本的相关性和一致性较好,但在检测免疫耐受期及高值样本时罗氏E170结果较雅培i2000偏高。临床上用HBs Ag预测抗病毒治疗的效果时,治疗前后应尽量选择同一系统的结果,以避免由于不同系统间的差异造成对治疗效果的错误评估。

MEIA检测低水平血清HBsAg及结果分析

目的 了解低水平血清乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的人群分布及其相关乙肝病毒血清标志物模式特征。方法 微粒子酶免疫分析技术（microparticle enzyme immunoassay，MEIA）测定8089例非肝炎病区住院患者血清HBsAg及其表面抗体（抗-HBs）、乙肝病毒e抗原及其e抗体（HBeAg、抗-HBe）和乙肝病毒核心抗体（抗-HBc）；根据定值参比血清和样本的HBsAg荧光速率值／阴性对照荧光速率值之比值（S/N值），并结合中和试验结果，确定浓度在5μg/L以下的HBsAg阳性例数，并分析相关乙肝病毒（HBV）血清标志物模式。结果 共检出HBsAg阳性816例，HBsAg浓度在5μg／L以下的有189例，占总数的2．34％，占HBsAg阳性人群的23．16％，其中，HBsAg浓度在1μg/L以下的有84例（44．04％）；1～2μg／L的有33例（17．5％）；2～5μg／L的有72例（38．10％）。对上述低水平HBsAg人群的5项HBV血清标志物检测获得8种模式，以“HBsAg、抗-HBc、抗-HBe阳性”，“HBsAg和抗-HBs阴性”模式为主（74．60％）；累计HB—sAg和抗-HBc同时阳性者占94．17％；HBsAg与HBs同时阳性只出现在HBsAg 1μg／L以下人群中（6．45％）。结论 低水平血清HBsAg人群不容忽视，提高HBsAg检测灵敏度有重要意义；同时检测相关HBV血清标志物，对于确定上述人群有帮助。

以金黄色葡萄球菌重组IsdB137-361为抗原的牛血清抗体间接ELISA检测方法建立

奶牛乳房炎是危害奶牛健康和影响奶业发展的重要而常见奶牛疾病,金黄色葡萄球菌(S.aureus)是引起奶牛乳房炎的重要病原菌,已经用S.aureus铁调节的表面决定簇B(IsdB)的免疫优势片段IsdB_(137-361)与其他抗原成分构建了预防S.aureus感染的奶牛乳房炎候选疫苗(命名为GIT)。为了检测该候选疫苗免疫奶牛后的IsdB_(137-361)相关抗原的血清抗体,用pGEX-6p-1表达的IsdB_(137-361)作抗原建立了牛血清抗体间接ELISA检测方法。通过对抗原包被浓度、血清稀释倍数和反应条件进行了优化,确定cut-off值检测了血清交叉反应性和敏感性。结果显示,在抗原使用浓度为2.5μg·mL^(-1)-1、血清1:1000倍稀释、cut-off值为0.45时,该方法具有良好的特异性和敏感性。表明,所建立的间接ELISA检测方法可用于IsdB_(137-361)相关抗原疫苗的免疫牛血清抗体检测。

“大三阳”患者HBeAg浓度与HBV复制水平的关系

目的分析"大三阳"患者的HBeAg浓度与HBV复制水平的关系,并探讨用化学发光法检测HBeAg浓度用于HB-sAg阳性病例与HBV复制水平的相关性。方法随机抽取其中血清"大三阳"患者共143例,应用荧光定量PCR(fuorescencequantitative PCR,FQ-PCR)和化学发光法(Chemiluminescence Immunoassay,CLIA)测定乙型肝炎病例的血清HBeAg浓度。比较不同DNA复制水平病例的HBeAg浓度,以及不同HBeAg浓度病例的DNA水平,同时进行HBeAg浓度与DNA水平相关性分析。结果血清HBeAg浓度与HBV DNA复制水平呈正相关,结论血清HBsAg和HBeAg阳性乙型肝炎病例血清HBeAg浓度与HBV复制水平有一定相关性,相关性R≥0.95。

牛源金黄色葡萄球菌铁离子调控蛋白保守性和免疫效果研究

为评价金黄色葡萄球菌铁离子调控蛋白B(IsdB)作为奶牛乳腺炎疫苗抗原的可能性,对我国分离的不同克隆复合群(CCs)3株菌的isdB基因进行序列测定、比对分析,并对XJ43(CC97)菌株的isdB基因进行原核表达、纯化,通过小鼠主动和被动免疫试验评价了其免疫保护效果。Blast分析显示,来源于不同克隆复合群菌株的isdB基因序列的同源性大于95%,说明isdB基因高度保守;IsdB蛋白主动免疫能显著降低攻毒菌对免疫鼠的损伤或免疫鼠的死亡率,而被动免疫不能降低小鼠的死亡率;用活的强毒力菌刺激产生的血清则能极显著地增加小鼠的存活率。本研究表明,虽然IsdB蛋白的主动免疫可以显著减弱金黄色葡萄球菌的致病作用,但以此单一成分为抗原的金黄色葡萄球菌疫苗的免疫保护效果具有很大的局限性。

乙肝病毒表面抗原‘a’决定簇变异对其抗原性的影响

目的探讨乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阴性HBV感染的发生与HBsAg‘a’决定簇区变异的关系。方法对7例HBsAg阴性HBV感染者的HBVS基因区序列进行分析,并与GenBank/EMBL/DDBJ数据库中的不同基因型参考序列进行比较,分析‘a’决定簇区氨基酸的变化情况。结果7例感染者中5例为adr/C型,2例为adw/B型,未发现其它亚型及基因型的存在。3例感染者的毒株在主要亲水区(MHR)内未发现氨基酸变异,另外4例感染者的毒株均存在不同程度的氨基酸替代,包括单点和联合突变,变异位点包括Q101K、T116I、K122N、T126N、Q129R/N、T131A、C138Y、N146S、C147F。结论HBsAg‘a’决定簇区变异不是形成HBsAg阴性HBV感染的唯一原因,但确是形成HBsAg阴性感染的一个重要因素。

穿膜肽修饰多功能靶向阿霉素脂质体处方优选及理化性质研究

目的对以PFVYLI(PFVY)修饰的阿霉素与五味子乙素共载脂质体进行处方优化,并建立脂质体中阿霉素和五味子乙素的含量测定方法。对制备得到的脂质体进行物理化学性质及药效学研究。方法利用薄膜-超声分散法与硫酸梯度法结合的方式制备PFVY修饰的阿霉素与五味子乙素脂质体。利用Box-Behnken响应面法对拟定处方中影响最终包封率的3因素(膜材比例、药脂比例、超声功率)进行优化。利用高效液相色谱法(HPLC)对脂质体中五味子乙素和阿霉素进行含量测定。通过透射电子显微镜及马尔文激光粒度仪对已制备的多功能阿霉素靶向脂质体形态、粒径、Zeta电位等理化性质进行研究。以含10%胎牛血清(FBS)的磷酸缓冲盐溶液(PBS)为释放介质,分别测定阿霉素与五味子乙素的体外释放率。利用不同组制剂对A549细胞和小鼠肺癌细胞(LLC)的细胞毒性试验进行药效学评价。结果优选后的处方为磷脂44 mg,胆固醇8 mg,五味子乙素1.8 mg,阿霉素0.49 mg,超声功率500 W,处方量为5 mL。此配方下的包封率为(96.30%±0.98)%(n=3),脂质体中五味子乙素含量为(359.80±1.26)μg/mL(n=3),阿霉素含量为(98.45±0.70)μg/mL(n=3)。制备得到的多功能靶向脂质体形态近球形,粒径适宜均匀,阿霉素和五味子乙素在48 h时的体外释放率分别为(32.91±2.08)%和(32.29±0.89)%(n=3)。体外药效学也在一定程度显示穿膜肽PFVY的作用与五味子乙素对阿霉素细胞毒性的增效作用。结论优化后所得处方稳定,包封率高,适用于PFVY修饰的阿霉素与五味子乙素脂质体的制备。针对脂质体建立的HPLC法准确且重现性好,可应用于五味子乙素和阿霉素的含量测定。制备得到的多功能靶向脂质体具有较好的临床应用潜力。

乙肝表面抗原固相放免定量药盒的特性

研究了乙肝表面抗原固相放免定量药盒的特性，包括ＨＢｓＡｇ标准品的稳定性、固相塑料珠的包被条件和标记物比活度对标准线性范围的影响。结果表明：在短时间高温条件下药盒稳定，较好的包被条件和适宜的标记物比活度能提高标准线性范围。药盒的线性范围为０—７７．６ｍＩＵ／ｍＬ，灵敏度为０．８ｍＩＵ／ｍＬ，回收率为８５％—１１０％，批内变异系数小于１５％，批间变异系数小于２０％。

不同厂家试剂盒检测人血清乙肝表面抗体浓度值相关性分析

目的:分析不同厂家试剂盒检测乙型肝炎病毒表面抗体浓度值差异,并探讨用化学发光法检测表面抗体浓度值对乙肝疫苗注射效果监测的意义。方法:选取中国生物制品检定所提供的国家参比品3份,国家临检中心质控品2份,表面抗体混合阳性稀释标本2份,特殊模式血清4份,表面抗体有反应性的血清39份,分别用雅培(Architect)全自动化学发光试剂、罗氏(Roche2010)全自动电化学发光试剂、安图生物化学发光试剂盒和化学发光仪测定乙型肝炎病毒表面抗体浓度。结果:不同厂家试剂盒检测表面抗体浓度存在一定的偏差,但相关性良好(相关系数R>0.95)。结论:由于化学发光法做为一种高灵敏、高特异、高准确的定量检测方法,定量检测表面抗体对评估乙肝疫苗注射效果的监测具有重要的意义。

表面抗原和抗体双阳性乙型肝炎患者HBVS基因“a”决定簇序列分析

目的分析HBsAg和抗-HBs双阳性乙型肝炎患者HBVS基因“a”决定簇序列特征。方法巢式PCR法扩增4例HBsAg和抗-HBs双阳性乙型肝炎患者HBVS基因，PCR扩增产物直接进行测序和克隆后测序，对获得的“a”决定簇序列进行比对分析。结果PCR扩增产物直接测序表明，4例患者HBV“a”决定簇低保守区各有1个氯基酸位点显示多态性。PCR产物克降后测序表明，病例1S基因“a”决定簇126位点（s126）氨基酸可为苏氨酸（T）、异亮氨酸（I）和丝氨酸（S），s134氦基酸可为苯丙氨酸（F）和丝氨酸（S）；病例2s126氨基酸可为丙氨酸（A）和苏氨酸（T）；病例3s126氨基酸可为异亮氨酸（I）和天冬酰胺（N）；病例4术发现多态性位点。结论HBVS基因“a”决定簇序列的多态性可能是引起乙型肝炎患者HBsAg和抗-HBs双阳性的原因之一。

乙型肝炎病毒“a”决定簇的变异对HBsAg定量的影响

目的为了明确乙型肝炎病毒"a"决定簇的变异对乙肝表面抗原(hepatitis B virus surface antigen,HBsAg)定量的影响。方法收集广州血液中心无偿献血者的乙肝HBsAg阳性血清标本,共41例;采用时间分辨免疫荧光法对乙肝HBsAg进行定量,根据HBsAg定量结果将标本分为两组:低HBsAg组(0.05~100 IU/mL)和高HBsAg组(>100 IU/mL);提取乙型肝炎病毒DNA,采用高灵敏度巢式PCR扩增病毒DNA的S区,对S区"a"决定簇氨基酸序列进行比对。结果 41例乙肝HBsAg阳性标本中,以B基因型为主,占75.6%;C基因型占24.4%;对HBV病毒S区"a"决定簇氨基酸置换位点和置换率进行分析,没有发现低HBsAg组(0.05~100 IU/mL)和高HBsAg组(>100 IU/mL)存在特异性的氨基酸置换位点。低HBsAg组与高HBsAg组S区中"a"决定簇的氨基酸置换率相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论乙肝病毒"a"决定簇的变异并不是影响HBsAg定量的主要因素。

乙型肝炎病毒表面抗体快速测定方法应用评价

目的对新开发的一种快速、敏感的乙型肝炎病毒表面抗体(乙肝疫苗保护性抗体)测定方法进行应用评价。方法与酶标法试剂盒同时对1 042份血清样本,62份血浆样本、92份全血样本进行临床比对测定。结果对1 042例临床血清样本、62份血浆样本和92份全血样本进行临床比对实验,与酶标法比对试剂符合率分别为96.2%、96.8%和95.7%。结论该方法能测定人的全血、血清、血浆样本中的乙型肝炎病毒表面抗体。本试纸条10 min内即可完成检测,具有简便快速、无需特殊仪器设备等优点,对测定人群中乙型肝炎病毒表面抗体或乙肝疫苗接种后人群中乙肝疫苗保护性抗体产生效果评价具有应用价值。

Excel软件规划求解功能拟合与优选血清乙型肝炎病毒大蛋白质量浓度标准曲线

目的探讨拟合和优选血清乙型肝炎病毒大蛋白(HBV-LP)质量浓度标准曲线的一种简便的实用方法。方法HBV-LP标准品吸光度检测采用酶联免疫吸附试验,利用Excel软件规划求解功能对HBV-LP标准品质量浓度与吸光度进行四参数方程模型、线性模型、对数线性模型、二次多项式模型、三次多项式模型、S模型的曲线拟合,根据各回归模型决定系数的大小来确定测定血清HBV-LP质量浓度的最适标准曲线。结果HBV-LP标准品质量浓度与吸光度的散点图呈非线性趋势;四参数方程模型、线性模型、对数线性模型、二次多项式模型、三次多项式模型、S模型的回归方程均有意义(P<0.001),决定系数分别为0.9995、0.9249、0.8765、0.9975、0.9989、0.9799,其中四参数方程模型、二次多项式模型、三次多项式模型、S模型的拟合精度较好,以四参数方程模型最佳。结论Excel软件规划求解是一种具有较高临床实用价值的血清HBV-LP质量浓度标准曲线的拟合与优选方法;四参数方程模型的拟合标准曲线是测定血清HBV-LP质量浓度的最适标准曲线。

SPSS和Excel对血清乙型肝炎病毒大蛋白浓度标准曲线的拟合效果比较

目的:考察SPSS和Excel对血清乙型肝炎病毒(HBV)大蛋白(-LP)浓度标准曲线的拟合效果。方法:HBV-LP标准品吸光度检测采用酶联免疫吸附试验,分别用SPSS软件曲线估计和Excel软件规划求解对HBV-LP标准品浓度与吸光度进行线性模型、对数线性模型、二次多项式模型、三次多项式模型的曲线拟合,比较两种拟合方法的各回归模型拟合效果的一致性,并根据各回归模型决定系数的大小来优选血清HBV-LP浓度标准曲线回归模型。结果:HBV-LP标准品浓度与吸光度的散点图呈非线性趋势;两种拟合方法的线性模型、对数线性模型、二次多项式模型、三次多项式模型的回归方程均有意义(P<0.001),其决定系数小数点后四位是一致的;其中二次多项式模型、三次多项式模型的拟合精度较高,决定系数均大于0.95。结论:Excel软件规划求解拟合血清HBV-LP浓度标准曲线的效果与SPSS高度一致,是一种临床实验室定量标准曲线拟合与优选的有效方法。