利用Red重组系统敲除APEC毒力岛irp2基因

应用质粒pKD46介导的Red同源重组系统,以质粒pKD3为模板,设计irp2基因序列敲除引物,引物5′端有51 bp的拟敲除基因的同源臂,3′端为扩增引物,扩增两侧含FRT位点的氯霉素抗性基因,通过第1次同源重组将拟敲除的irp2基因替换为氯霉素抗性基因,再通过重组酶质粒pCP20在FRT位点发生第2次同源重组,消除抗性基因。结果表明,利用该重组系统成功敲除了禽致病性大肠杆菌HPI毒力岛irp2基因。为深入研究irp2基因在禽致病性大肠杆菌致病过程中所发挥的作用打下基础。

禽源性大肠杆菌HPI毒力岛irp2基因PCR检测方法的建立与应用

为了解临床禽源致病性大肠杆菌中高致病性毒力岛(High pathogenicity island HPI)流行情况和基因特征,根据Gen Bank已知禽源irp2基因序列,设计、合成一对特异性引物,建立irp2基因PCR检测方法,优化、确定PCR扩增特性,进行敏感性、特异性、重复性检测评价。对256份临床分离禽源大肠杆菌进行irp2基因PCR检测和基因遗传变异分析。结果显示,建立的PCR检测方法敏感性可达2.14×10^(-4)ng/μL;特异性显示与鸡沙门菌、副鸡嗜血杆菌、鸭疫里默菌、禽巴氏杆菌、鸡毒支原体、鸡新城疫病毒、禽流感病毒(H9N5)核酸均无交叉反应;重复性显示3份阳性样品重复5次检测,变异系数3.4%~5.0%。256份临床样品PCR检测irp2基因,阳性率30.6%。获得了9株分离株irp2基因序列,分析显示,与GenBank已知基因同源性高达96.2%以上。说明建立的禽源大肠杆菌HPI毒力岛irp2基因PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可应用于临床致病性大肠杆菌毒力岛基因快速检测。

撒坝猪大肠杆菌血清型鉴定及药敏试验与HPI irp2基因的检测

为了对云南省楚雄和禄丰地区撒坝猪大肠杆菌血清型及药物敏感性与irp2基因的关系,试验采集疑似猪大肠杆菌病患猪的心脏、肝脏和粪便等病料,用于大肠杆菌的分离培养、形态学观察、生化鉴定,并进行了血清型鉴定与药敏试验和irp2基因的检测。结果表明:共鉴定出大肠杆菌50株,10种血清型,其中O20、0101、O14、O5、O9为优势血清型;头孢类、四环素类、氨基糖苷类和青霉素类这4种药中,以头孢类的头孢他啶作用最强;50株大肠杆菌中有12株(24%)扩增出434 bp的基因片段,其PCR产物测序结果与GenBank中公布的耶尔森菌强毒力岛(HPI)irp2基因的同源性达96%以上。说明irp2基因与血清型的致病性有关。

致病性大肠埃希菌高致病性毒力岛irp2基因序列的扩增与分析

目的探讨致病性大肠埃希菌(EPEC)中高致病性毒力岛(HPI)irp2基因与致病性的关系。方法根据Genebank中irp2基因设计特异性引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增基因全长,克隆入pUCm-T载体,并通过酶切和测序鉴定。结果160株EPEC中有16株(10.00%)扩增出278bp基因片段,该基因片段与GeneBank中公布的耶尔森菌HPIirp2基因的同源性高达97%以上。结论部分EPEC具有耶尔森菌毒力岛HPI基因序列,该毒力岛可能与EPEC的致病性有一定相关性。

PEC HPI irp2基因缺失株的构建及蛋白结构功能预测

为了探讨致病性大肠杆菌内HMWP2蛋白的生物学结构和功能,采用Red同源重组技术,对致病性E.coli的HPI irp2基因进行敲除,成功构建了致病性E.coli irp2基因缺失株,并利用测序结果对HMWP2蛋白进行了多重预测分析,以期为致病性大肠杆菌相关疾病的防治和发生机理研究提供理论基础。

云南撒坝猪EPEC HPI irp2缺失株的摄铁能力研究

【目的】本研究探讨了云南撒坝猪EPEC HPI毒力岛的摄铁功能与致病性之间的关系。【方法】本试验通过摄铁实验对5株肠致病性E.coli(A-E)和CVCC1565铁载体的合成和在不同2,2’-联吡啶含量下的最低生长抑制浓度及对数期生长速率进行了测定,同时利用已构建的E.coli irp2基因缺失株和亲本株进行对比,检测HMWP2蛋白的表达,并通过半数致死量实验比较两者之间的毒力。【结果】除E.coli(D)外,其余菌株的2,2’-联吡啶最低生长抑制浓度为0.6 m M;亲本株能够表达HMWP2蛋白,irp2缺失株不表达该蛋白;CAS固体培养基中菌株能产生橘黄色的透明晕圈;当2,2’-联吡啶浓度高于0.2 m M时,亲本株的生长率高于irp2缺失株;亲本株的LD50(8.73×10~7cfu/m L)低于缺失株(9.95×10~7cfu/m L)。【结论】云南撒坝猪EPEC HPI铁摄取功能和致病性之间存在着一定关系。

新疆奶牛乳源大肠杆菌Irp2毒力岛的克隆及序列分析

采集新疆奶牛隐性乳腺炎乳样,经分离、鉴定,从中得到乳源大肠杆菌,并将大肠杆菌菌株用大肠杆菌O因子血清标定。根据GenBank已发表的Irp2基因序列,用Oligo 6.0生物软件设计一对特异性引物。对分离得到的大肠杆菌菌株提取基因组DNA,利用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。结果表明,所分离大肠杆菌中Irp2基因阳性率为35.3%(12/34),阳性样品的测序结果与已发表的Irp2基因序列高度同源,同源率在98%以上。同时发现Irp2基因的阳性率与血清型并没有相关性。

应用CRISPR/Cas9系统构建大肠埃希氏菌irp2基因缺失株

CRISPR/Cas9是一个新兴的基因编辑技术,利用该技术对临床分离的撒坝猪致病性大肠埃希氏菌中的irp2基因进行编辑,为进一步研究该基因在致病中的作用提供基础。首先构建靶向irp2基因的sgRNA,PCR扩增上、下游同源臂,利用重叠PCR技术连接sgRNA与上、下游同源臂,再通过酶切与酶连构建出靶向irp2基因的pTargetF重组质粒。将pCas与pTargetF重组质粒转化临床分离的撒坝猪致病性大肠埃希氏菌中,成功构建了该菌株的irp2基因缺失菌株,为进一步研究其致病机制奠定基础。

一株多耐药撒坝猪致病性E. coli irp2基因缺失菌株的构建

Red同源重组是大肠埃希菌基因编辑的一个重要工具,pKD46、pKD3/4和pCP20是该操作中常用的工程质粒,通常以氨苄青霉素、卡那霉素和氯霉素作为筛选标记。在对一株分离自腹泻撒坝仔猪的致病性大肠埃希菌进行irp2基因敲除时发现该菌对氨苄青霉素、氯霉素等多种抗生素不敏感,是一株多耐药菌株,给筛选带来了困难。为了解决这个问题,我们构建了携带博来霉素抗性的打靶片段和携带FLP酶的重组质粒pCas-FLP,成功实现了该菌株的irp2基因缺失,为进一步研究该基因致病机制提供了基础,同时也为多耐药菌株的基因编辑提供了一种新的方法。

APEC强毒力岛核心基因irp2、fyuA敲除对其致病性影响的研究

采用Red同源重组技术分别构建出APEC irp2单基因敲除株△AE17和irp2、fyuA双基因敲除株△△AE17。运用活菌计数法分别观察AE17、△AE17、△△AE17黏附鸡胚成纤维细胞DF-1的能力。并且应用Real-time PCR检测AE17、△AE17和△△AE17中的luxs,pfs,tsh,ibeA,stx2f,iss,ompA,fimC 8个毒力基因转录水平。结果成功构建出基因敲除株△AE17和△△AE17,它们黏附DF-1细胞的能力分别下降为AE17的66.04%和53.54%。同时,Real-time PCR结果显示,△AE17的luxs,iss,ompA和fimC等4个毒力基因的转录水平均极显著下降(P<0.01),△△AE17的luxs,pfs,tsh,iss,ompA和fimC等6个毒力基因的转录水平极显著的下降(P<0.01)。结果表明强毒力岛中核心基因的敲除能够减弱APEC黏附DF-1的能力,并且使其毒力基因的转录水平有所降低。irp2、fyuA双基因敲除较irp2单基因敲除对APEC的致病性影响更显著。

禽致病性大肠杆菌HPI毒力岛irp2蛋白表达、纯化及其间接ELISA方法建立

PCR扩增irp2主要抗原表位区，构建pET32a—irp2表达载体，转化BL21（DM3）细胞诱导表达。以纯化irp2蛋白为抗原建立ELISA检测方法，确定抗原包被浓度、血清稀释度、封闭液与封闭条件和临界值等参数，进行ELISA性能检测及应用。结果显示，PCR扩增出约519bp特异性irp2主要抗原表位基因，经菌液PCR、双酶切及DNA测序显示成功构建pET-32a—irp2表达栽体。irp2目的蛋白获得有效表达，相对分子质量大小约34500，亲和纯化后纯度达90％以上。Westernblot显示目的蛋白irp2与抗血清在约34500出现特异性显示条带。确定ELISA抗原包被质量浓度3．25mg／L、血清稀释度1：80，封闭液为5％脱脂奶粉，封闭条件37℃1h＋4℃10h，临界值为0．320。性能检测显示，其敏感性可达1：5120；与鸡白痢沙门菌、鸡传染性鼻炎、鸡霉形体、鸡巴氏杆菌、HPI大肠杆菌等血清无交叉反应特异性，批内、批间变异系数分别为3．40％～6．71％和5．20％～8．44％；与PCR方法对124份血清平行试验其符合率93．8％；对1425份临床血清样品irp2抗体阳性检出率37．4％。结果表明，建立了可检测血清中irp2蛋白抗体的间接ELISA方法，适用于临床血清样品进行快速抗体检测，为HPI大肠杆菌的流行病学调查和致病性大肠杆菌免疫机制研究奠定基础。

禽源大肠杆菌耶尔森氏菌强毒力岛核心基因的检测及其irp2和int基因同源性

【目的】为了提高禽源大肠杆菌中耶尔森氏菌强毒力岛(HPI)的检测效率,了解高分子量铁调节蛋白2基因(irp2)和整合酶基因(int)在不同株禽源HPI+大肠杆菌间的同源性,进一步揭示禽源大肠杆菌HPI的转移规律。【方法】利用L16(44)正交试验设计,建立针对HPI核心基因irp2和fyuA的双重PCR,运用双重PCR方法检测禽源大肠杆菌临床分离株,并对检出的7株HPI阳性(HPI+)大肠杆菌进行irp2和int基因测序及同源性分析,同时结合这7株大肠杆菌的ERIC-PCR分析结果,对比分析int基因的分布特点。【结果】结果显示,新建立的双重PCR能特异性扩增出HPI核心基因;ERIC-PCR分析显示,HPI+大肠杆菌间差异均大于5%;HPI+大肠杆菌irp2基因高度保守(同源性大于99%),而int基因虽然都位于asn-tRNA位点,但基因序列在部分菌株间存在较大差异。【结论】建立了一种可以用于HPI的流行病学调查和实验室诊断的双重PCR方法,并推测区域外同源重组可能是HPI基因在大肠杆菌间水平转移的主要方式。

腹泻仔貉检出携带耶尔森菌HPI毒力岛的大肠杆菌

目的为了解大肠杆菌引起仔貉腹泻的机理,进行了小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因的检测,并对其菌株作毒力试验。方法用PCR扩增法检测毒力岛基因irp2和fyua,小鼠腹腔注射检测菌株毒力。结果从3个貉场腹泻病死貉脏器以及粪便中分离出血清型分别为O23和O20的大肠杆菌,对两血清型大肠杆菌进行毒力岛检测,均检出携带小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因irp2和fyuA。2个血清型O23、O20大肠杆菌均分别使小鼠发病死亡。结论仔貉腹泻是由携带小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因irp2和fyua的大肠杆菌引起,该菌对仔貉的健康具有潜在的威胁。

牙鲆致病性迟钝爱德华菌毒力基因的检测及序列分析

为探讨牙鲆致病性迟钝爱德华菌毒力基因携带与分布,以毒力基因为分子靶标研究其致病机理及建立快速检测方法,根据GenBank上的基因序列,设计2对引物扩增致病性迟钝爱德华菌毒力基因fimA和小肠结肠炎耶尔森菌毒力基因irp2,结果在7个供试牙鲆病例的130株致病性迟钝爱德华菌中,irp2毒力基因的阳性率为46.15%(60/130),fimA毒力基因的阳性率为100%,且均与已发表的参考菌株相应序列高度同源,同源性分别为97.32%和97.59%。可见耶尔森菌强毒力岛(HPI)在牙鲆致病性迟钝爱德华菌中广泛分布,但不同病例分离菌株间存在差异;fimA毒力基因存在于所有的被检致病性迟钝爱德华菌中,可以作为快速检测致病性迟钝爱德华菌的标志物。

禽大肠杆菌毒力岛主要摄铁基因及生物膜的检测

以临床病禽分离17株E.coli为研究对象,分别检测分离菌株的毒力岛中irp2、irp3、irp4、irp5和生物膜形成能力。先用irp2 PCR扩增检出7株致病性大肠杆菌,并对其进行ERIC-PCR分型,结果分为2个类型。又对分离株进行irp3、irp4和irp5基因检测,结果分离株中irp2、irp3、irp4和irp5的阳性检出率分别为41.2%、64.7%、29.4%和35.3%;最后对分离株进行生物膜形成能力的检测,结果携带irp2的阳性菌株都有较强的生物膜形成能力。结果提示,禽致病性大肠杆菌的HPI中irp2与生物膜的形成有一定的关联。

银川地区鸡源致病性大肠杆菌耶尔森菌强毒力岛相关基因的检测及序列分析

为了研究耶尔森菌强毒力岛(HPI)在银川地区鸡源致病性大肠杆菌中的分布情况,试验根据HPI相关基因irp2和fyuA的参考序列设计引物,采用双重PCR方法对分离的20株鸡源致病性大肠杆菌进行这两种基因的扩增和检测,以及基因克隆和核苷酸序列分析。结果表明:irp2和fyuA基因在鸡源致病性大肠杆菌分离株中的阳性率均为40%(8/20);这两种毒力岛相关基因的核苷酸序列与GenBank中报道的基因核苷酸同源性高达98%以上。说明irp2和fyuA基因具有较高的保守性。

华南虎源大肠杆菌的快速鉴定及致病特性的初步研究

从患病华南虎分离病原菌,进行快速鉴定,同时以大肠杆菌16S rRNA基因的通用引物和irp2、papC、iucD、tsh、iss毒力基因的特异性引物进行PCR扩增、测序,并将扩增出来的irp2、iucD、iss基因序列与Genbank相应序列进行同源性分析。测序鉴定为大肠埃希氏菌,与传统细菌鉴定方法结果相一致,分离菌携带irp2、iucD、iss毒力基因,从毒力试验得到证实。其序列与Genbank上发表的iucD、iss基因序列同源性分别高达98%、99%,而irp2基因序列的同源性仅为48%。采用16S rRNA基因序列分析法可以对华南虎大肠埃希氏菌感染进行快速鉴定,华南虎源性大肠杆菌同时携带有irp2、iucD、iss 3个毒力基因,可能与其致病性有关系。

黑颈鹤源大肠杆菌的快速鉴定及致病特性的初步研究

对黑颈鹤病原菌进行快速鉴定及毒力因子分析。采用16S rRNA序列分析法鉴定黑颈鹤病原菌,其毒力基因分别用大肠杆菌的irp2、papC、iucD、tsh、iss毒力基因的特异性引物进行PCR检测,并将扩增出来的irp2基因序列与Genbank^(TM)相应序列进行同源性分析。分离菌株鉴定为大肠埃希氏菌,鉴定结果与生化检测结果一致,分离菌携带irp2毒力基因,这从毒力试验得到证实,其序列与与Genbank^(TM)上发表的HPI irp2基因序列同源性高达98%以上。采用16S rRNA序列分析法可以对黑颈鹤大肠埃希氏菌感染进行快速鉴定,黑颈鹤源性大肠杆菌携带有irp2毒力基因。

狐源大肠杆菌毒力基因的检测

为检测东北地区135株狐源大肠杆菌主要毒力基因,并研究其流行情况,采用PCR法检测分析了狐源大肠杆菌irp2,fyu A,fim H,iuc D,iss,ybt A 6个毒力基因。结果显示irp2,fyu A, fim H, iuc D, iss, ybt A的阳性率分别为42. 22%, 9. 63%, 41. 48%,12. 59%,0. 07%,8. 15%,黏附相关基因fim H及铁载体相关基因irp2检出率较高,fim H,irp2是狐源大肠杆菌主要毒力基因。

α-硫辛酸促进帕金森病大鼠黑质细胞铁转出的机制

目的检测α-硫辛酸(α-LA)对帕金森病(PD)模型大鼠中脑黑质的铁调节蛋白2(IRP2)、膜铁转运蛋白1(FP1)表达的影响,探讨α-LA在PD模型大鼠黑质调节铁转出的机制。方法健康雄性SD大鼠60只,随机分为假手术组(n=15)、模型组(n=45)。采用立体定位技术将6-羟基多巴胺(6-OHDA)注入大鼠右侧纹状体建立PD模型,假手术组注入同等量的生理盐水。4周后,取30只模型大鼠随机分为PD模型组(n=15)和PD治疗组(n=15)。PD治疗组腹腔注射α-LA 50 mg/(kg·d),连续2周,PD模型组给予同等量生理盐水。治疗14 d后,用圆筒试验(cylinder test)测试大鼠左前肢的使用率;取各组大鼠右侧中脑黑质,采用免疫组织化学染色法检测酪氨酸羟化酶(TH)的表达和分布,采用普鲁士蓝染色法检测铁阳性细胞的数量变化,采用Western blot法检测IRP2和FP1的水平。结果与假手术组相比,PD模型组左前肢使用率显著降低;TH阳性细胞数明显减少,黑质铁阳性细胞数量明显增加;IRP2水平明显增加,FP1水平降低。与PD模型组相比,PD治疗组左前肢使用率明显增加;TH阳性细胞数明显增加,黑质铁阳性细胞数量明显减少;IRP2水平降低,FP1水平增加。结论α-LA能够下调IRP2水平,通过IRP2/IRE通路,上调FP1水平,促进细胞对铁离子的转出,降低PD模型大鼠黑质的铁沉积,减轻6-OHDA诱导的PD模型大鼠脑损伤。