新生SD大鼠岛源性胰岛祖细胞的分离培养与诱导分化

目的:分离培养新生大鼠岛源性胰岛祖细胞,观察GLP-1(7-36)NH2诱导其向成熟细胞分化作用。方法:分离与纯化胰岛,在含20μg/L EGF和20μg/L bFGF的RPMI1640培养基中分离和扩增胰岛祖细胞,用20nmol/LGLP-1(7-36)NH2诱导分化。用原位杂交、免疫细胞化学染色、二硫腙(DTZ)染色和放射免疫分析等方法对的胰岛祖细胞分化前后细胞特征进行初步鉴定。结果:胰岛祖细胞表达Nestin,不表达PDX-1、Insulin mRNA、Insulin、So-matostatin。以GLP-1(7-36)NH2诱导分化后,部分细胞表达PDX-1、胰岛素mRNA、胰岛素、生长抑素,胰岛样细胞团(ICCs)形成,其周边细胞DTZ着色。分化3周后培养基中胰岛素释放明显增加。结论:在新生SD大鼠胰岛存在有一类胰岛祖细胞,可以被分离并在体外不断扩增。GLP-1(7-36)NH2可以诱导胰岛祖细胞形成有胰岛素分泌功能的胰岛样细胞团。

GLP-1(7-36)NH_2对新生大鼠胰岛祖细胞的诱导分化作用

目的:观察GLP1(736)NH2对新生大鼠胰岛祖细胞的诱导分化作用。方法:从新生大鼠胰岛中分离培养胰岛祖细胞,用含20nmol/LGLP1(736)NH2的RPMI1640完全培养基诱导分化4周(GLP1组,n=5),以RP MI1640完全培养基作对照(n=5)。免疫细胞化学染色检测诱导分化前后细胞Nestin、PDX1、胰岛素、生长抑素的表达;放射免疫法测定每周末培养基中胰岛素含量(胰岛素分泌量);二硫腙染色观察形成的胰岛样细胞团(ICCs),4周后计数每25cm2中直径>50μm的ICCs数目。结果:诱导前胰岛祖细胞不表达PDX1、胰岛素、生长抑素,仅表达Nestin。诱导4周后,GLP1组PDX1、胰岛素、生长抑素表达阳性率和ICCs计数均高于对照组(P<0.05)。GLP1组诱导3周、4周后胰岛素分泌量高于对照组(P<0.05)。结论:GLP1(736)NH2可以促进胰岛祖细胞分化成熟,形成有胰岛素分泌功能的ICCs。

多步骤诱导逐步筛选法建立高效的胚胎干细胞定向分化为胰岛祖细胞的分化方案

目的探讨胚胎干细胞(ESCs)体外定向分化为胰岛祖细胞的分化潜能,应用多步骤诱导逐步筛选法建立高效的胚胎干细胞定向分化为胰岛祖细胞的分化方案,提高胚胎干细胞向胰岛祖细胞分化的效率。方法体外传代培养ESCs,采用逐步筛选分化方案,在不同的分化阶段,给予不同的生长因子诱导分化后,RT-PCR法检测胰腺特异性基因的表达,筛选最佳的诱导因子组合,并用免疫细胞化学方法鉴定相关特异蛋白的表达,从而建立体外高效的定向分化方案。结果从未分化ESCs定向分化为定形内胚层细胞,以活化素A诱导组的Sox17和Foxa2基因表达最显著;从定形内胚层细胞分化到后前肠细胞,以维甲酸+FGF10诱导组的Hnf4a和Hnf6基因表达最显著;从后前肠细胞定向分化到胰腺内胚层细胞,以维甲酸+环杷明+DAPT+Exendin 4诱导组的Pdx1、Ptf1a、Hblx9等胰腺特异性基因表达最显著;从胰腺内胚层细胞定向分化到胰岛祖细胞,以维甲酸+DAPT+Exendin 4诱导组的Ngn3、Nkx6.1、Pax4、Pax6等基因表达最显著。免疫细胞化学方法检测可见胰腺特异性的相关蛋白表达,多数Ngn3+细胞同时表达胰腺特异性基因Nkx6.1和Pdx1。结论应用多步骤诱导逐步筛选法可以建立高效的ESCs定向分化为胰岛祖细胞的分化方案,提高ESCs向胰腺内胚层分化的分化效率,为1型糖尿病的β细胞再生治疗提供试验依据和可行性方案。

不同培养基对干细胞-胰岛复合物培养后形态和功能的影响

探讨3种培养基对干细胞包被胰岛形态和功能的影响。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)、内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)、新生猪胰岛细胞(neonatal porcine islet cell clusters,NICCs)混合后分别用NICC培养基(A组)、MSC培养基(B组)、EPC培养基(C组)培养,观察各组中NICCs形态、分泌功能、基因表达水平及混合细胞凋亡率。C组破碎细胞数量明显比A、B两组少,凋亡率低,胰岛素和胰高血糖素基因的mRNA相对表达量高(P<0.05)。EPC培养基对NICCs的保护作用最优。

成人胰岛来源的Nestin阳性前体细胞的体外培养及其诱导分化

目的探讨成人胰岛来源的Nestin阳性前体细胞的体外培养、扩增及诱导分化为具有分泌胰岛素功能的B细胞的条件。方法首先通过胶原酶消化的方法从成人胰腺组织中分离纯化出胰岛,在含有bFGF及EGF的增殖培养基中大量扩增获得Nestin阳性前体细胞,最后在含有HGF、activin-A、exendin-4等生长因子的培养基中诱导该前体细胞。结果来源于成人胰岛的Nestin阳性前体细胞在体外可以大量扩增并表达ABCG2,而胰岛素不表达。在分化培养基中能分化为对高糖刺激反应的胰岛B细胞,胰岛素呈现阳性。结论来源于成人胰岛的Nestin阳性前体细胞能够为今后糖尿病的细胞移植治疗提供大量有功能的B细胞,能够解决目前胰岛移植中供体来源不足的问题。

Recent advances in tissue stem cells

Stem cells are undifferentiated cells capable of self-renewal and differentiation,giving rise to specialized functional cells.Stem cells are of pivotal importance for organ and tissue development,homeostasis,and injury and disease repair.Tissue-specific stem cells are a rare population residing in specific tissues and present powerful potential for regeneration when required.They are usually named based on the resident tissue,such as hematopoietic stem cells and germline stem cells.This review discusses the recent advances in stem cells of various tissues,including neural stem cells,muscle stem cells,liver progenitors,pancreatic islet stem/progenitor cells,intestinal stem cells,and prostate stem cells,and the future perspectives for tissue stem cell research.

胚胎干细胞体外定向分化为Ngn3＋胰岛祖细胞的基因表达谱分析

目的探讨胚胎干细胞体外定向分化为胰岛祖细胞的基因表达谱。方法采用逐步诱导分化方案体外传代培养胚胎干细胞，应用RT—PCR和免疫细胞化学方法鉴定各分化阶段相关特异基因的表达，应用Illumina MouseRef-8 v1．1小鼠基因表达谱芯片测定胚胎干细胞来源的不同阶段的分化细胞（第4、8、15、20、22和25天）与未分化胚胎干细胞的基因组表达谱。结果本研究得到了86个阶段特异性表达基因．6组具有相同表达趋势的基因簇，6组阶段差异表达基因组。从数量上看，差异表达基因最多的阶段是后前肠阶段（201个基因），接下来是定形内胚层细胞阶段（17个基因）。结论应用基因芯片对胰腺发育过程中具有相同表达趋势的基因和阶段差异表达基因的分析为早期胚胎发育和胰腺发育研究提供了试验依据。

ICR小鼠胰岛内nestin阳性细胞的分离培养及特性鉴定

通过向ICR小鼠胆总管注射胶原酶Ⅴ的方法体外分离胰岛,并从中分离培养出nestin+细胞,之后通过低糖、低血清诱导其分化产生类胰岛样细胞团。结果显示,小鼠胰岛内存在nestin+细胞,将其分离纯化后在体外低糖(2.5mmol/L)和低血清(2%)条件下可诱导分化为胰岛样细胞团;表明nestin+细胞具有胰腺干/祖细胞的特性。

人胚胎干细胞体外定向诱导分化胰腺前体细胞及胰岛细胞移植治疗NOD/SCID糖尿病小鼠

目的 探讨人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs）体外定向诱导分化胰腺前体细胞及胰岛细胞移植治疗非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷（non-obese diabetic/severe combined immunodeficient,NOD/SCID）小鼠的可行性.方法 体外分4阶段诱导hESCs定向分化为胰岛细胞：①诱导分化形成定型内胚层;②诱导胰腺细胞定向分化;③扩增胰腺前体细胞;④促进胰岛细胞成熟.观察诱导各阶段细胞形态变化、免疫荧光鉴定胰十二指肠同源异型盒基因（PDX-1）、胰高糖素（glucagon）、胰岛素（insulin）、C肽（C-peptide）、葡萄糖转运子2（Glut-2）的表达.3阶段及4阶段分化形成的细胞分别植入链脲菌素（streptozotocin,STZ）诱导形成的NOD/SCID糖尿病小鼠一侧附睾脂肪垫内,观察血糖变化.结果 hESCs诱导4阶段细胞表达胰高血糖素、胰岛素、Glut-2;共表达PDX-1和C肽;流式鉴定诱导4阶段胰岛素阳性细胞为17.1％;体外检测有葡萄糖刺激的胰岛素释放反应;3阶段及4阶段分化形成的细胞分别植入NOD/SCID 糖尿病小鼠体内可逆转其高血糖至少12周.结论 体外定向诱导hESCs分化形成的胰腺前体细胞及胰岛细胞分别植入NOD/SCID小鼠可逆转其高血糖.