半自动消化法分离纯化人胰岛细胞的实验研究

目的探索用半自动胰腺消化系统建立大规模人胰岛细胞纯化的可靠方法。方法使用自制的半自动人胰腺消化分离装置及胶原酶P进行人胰腺的消化分离,用COBE2991细胞分离机及HCA-Ficoll纯化人胰岛细胞。通过DTZ染色,在倒置显微镜下计数胰岛细胞的数量和纯度,用胰岛素释放试验检测胰岛细胞的分泌功能。结果消化后平均每条胰腺可平均获得(386201±78219)个胰岛细胞当量(IEQ),纯化后平均每条胰腺可获得231420±28054IEQ,平均每克胰腺组织可获得(3148±317)IEQ,纯化后胰岛细胞平均纯度为(62.81±2.68)%。纯化后的胰岛细胞对胰岛素释放刺激反应良好,高糖(16.7mmolL)时胰岛素的释放量为低糖(3.3mmolL)时的3.53倍(P≤0.001)。结论成功建立了半自动人胰岛细胞分离、纯化的方法,纯化的人胰岛细胞具有良好的生物活性。

诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的实验研究

目的建立一种体外诱导干细胞分化的胰岛细胞形成胰岛样结构的技术方法。方法体外诱导人胚胎胰腺干细胞分化为胰岛细胞,将胰岛细胞制备成浓度分别为1×104/ml、3×104/ml、1×105/ml、3×105/m(l1×104/ml、3×104/ml、1×105/ml、3×105/ml组)单细胞悬液,在含有细胞外基质(ECM)的培养基中悬浮培养24h以诱导形成胰岛样结构,在荧光体视显微镜下观察胰岛样结构的形态和大小;采用免疫荧光染色方法检测胰岛样结构中ECM成分及其细胞组成与定位。将胰岛样结构分别在含5.6和30.0mmol/L葡萄糖的培养基中体外培养2h,采用放射免疫法测定上清中胰岛素水平。建立糖尿病大鼠模型,经门静脉将胰岛样结构移植至大鼠肝脏,移植后连续3d经鼠尾静脉检测血糖水平。结果90%人胚胎胰腺干细胞分化的胰岛细胞形成了胰岛样结构,其包膜、大小均与天然人胰岛组织结构相似;以形成直径150μm大小胰岛样结构的比例为标准,比较各组细胞浓度与胰岛样结构形成率的关系,结果显示分别与1×104/ml、3×104/ml、3×105/ml组(25.0%±2.5%、28.0%±3.0%、21.5%±2.5%)相比,1×105/ml组胰岛样结构形成率最佳(36.5%±4.0%,均P<0.01)。胰岛样结构包膜上含有与天然人胰岛组织类似的ECM成分,且其中含有胰岛素、胰高血糖素和C-肽阳性细胞,其细胞比例与分布均与天然人胰岛组织类似。30.0mmol/L高糖浓度刺激后胰岛样结构胰岛素释放水平[(110±12)μIU/ml]较5.6mmol/L基础糖浓度[(59.5±8.0)μIU/ml]明显增加(P<0.01),胰岛样结构移植后糖尿病大鼠血糖水平较移植前均明显降低(P<0.01)。结论本研究建立的技术方法可以将干细胞分化的胰岛细胞在体外大量、快速、高效地诱导形成具有功能的胰岛样结构。

血管紧张素受体拮抗剂对2型糖尿胰岛β细胞功能的影响

【目的】观察厄贝沙坦对2型糖尿病（T2DM）患者胰岛β细胞功能影响。[方法]62名T2DM患者分为观察组34例及对照组28例，对照组予以饮食控制及胰岛素治疗，治疗组在对照组的基础上加服厄贝沙坦0．15g口服，一天一次。治疗前、治疗三个月后分别进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和C肽释放试验，比较两组治疗前和治疗后血糖（PG）、稳态模型评估法胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）、胰岛细胞功能指数（HOMA-β）、胰岛素分泌指数[糖负荷30min净增C肽与净增葡萄糖的比值（△C30／△G30）及以糖负荷120min净增C肽与净葡萄糖的比值（△C120／△G120）]。【结果】①两纽空腹血糖（FPG）、糖负荷后2小时血糖（2hPG）、糖化血红蛋白（HbAlc）治疗三个月前后差异有统计学意义（均为P〈0．05）；治疗前及治疗后两组之间差异均无统计学意义（P〉0．05）。②胰岛功能指标：两组HOMA-IR，HOMA-β、△C30／△G30、△C120／△G120治疗三个月前后差异均有统计学意义（均为P〈0．05）；治疗前两组各指标之间差异无统计学意义（P〉0．05）。三个月后观察组较对照组各指标改善显著，两组之间差异有统计学意义（P〈0．05）。【结论】厄贝沙坦治疗T2DM，能显著改善胰岛β细胞功能。

过氧化氢对胰岛微血管内皮细胞钙非依赖型磷脂酶A_2表达的影响

目的:研究过氧化氢(H2O2)对胰岛内皮细胞钙非依赖型磷脂酶A2(iPLA2)mRNA表达的影响.方法:用0,30,100和300μmol/L H2O2诱导IMECs 8 h后进行RT-PCR检测;用300μmol/L H2O2分别诱导0,4,8和12 h后应用RT-PCR技术进行iPLA2基因表达的检测.采用Annexin V-FITC/PI双染色检测细胞的凋亡率;采用DIOC6(3)染色检测细胞线粒体膜电位.结果:①300μmol/L H2O2作用12 h的电泳条带亮度与其他组(0,30,100μmol/L)相比明显减弱,300μmol/L H2O2作用8 h及12 h的电泳条带亮度与0,4 h相比明显减弱.②各浓度H2O2处理组(0,30,100和300μmol/L)IMECs凋亡率差异具有统计学意义[分别为(2.0±0.5)%,(19.1±5.8)%,(28.4±4.9)%,(40.1±5.1)%,P<0.01];300μmol/L H2O2处理0,4,8,12 h后,各时间点IMECs凋亡率差异具有统计学意义(P<0.01);③各浓度及各时间点H2O2处理组IMECs细胞内DIOC6(3)的荧光强度差异具有统计学意义(P<0.01).结论:H2O2对IMECs iPLA2的表达具有抑制作用,其抑制作用呈量效及时效关系.

脂肪干细胞对大鼠胰岛细胞脂性凋亡的保护作用

[目的]探讨脂肪干细胞（ADSCs）对棕榈酸（PA）诱导大鼠胰岛瘤细胞（INS-1）凋亡的保护作用。[方法]本实验分为三组。空白对照组：正常培养液＋INS-1单独培养（其上层只含培养基）；PA组：含0．5mmol／LPA的高脂培养液＋INS-1单独培养；INS-1＋ADSCs组：高脂培养液＋INS-1＋ADSCs共培养。各组在处理24h后检测各组细胞的存活率、胰岛细胞基础胰岛素分泌量（BIS）和葡萄糖刺激的胰岛素分泌量（GSIS）；采用RT-PCR检测胰岛细胞中Ins-1、Glut-2、Pdx-1表达量；采用Elisa检测各组IL-6、TNF—α、HGF、TIMP—1和TGF—β水平。[结果]PA组和PA＋ADSCs组细胞存活率均较对照组下降（P〈0．01），但PA＋ADSCs组细胞存活率明显大于PA组（P〈0．01）。与对照组相比，PA组和PA＋ADSCS组BIS增加（P〈0．01），而GSIS均减少（P〈0．01）；与PA组比较，PA＋ADSCs组细胞BIS差异无统计学意义（P〉0．05），而GSIS显著增加（P〈0．01）。和对照组相比，PA组和PA＋ADSCs组的Pdx-1、Ins-1、Glut-2mRNA水平均明显下降（P〈0．01）；和PA相比，PA＋ADSCs组细胞的Pdx-1和Glut-2mRNA水平明显上升（P〈0．01），而Ins-1mRNA水平比较差异无统计学意义（P〉0．05）。PA＋ADSCs组中IL-6、TNF-α、HGH、TIMP-1、TGF-β的含量均较其他两组明显升高。[结论]PA能诱导INS-1细胞凋亡并抑制Ins-1、Glut-2、Pdx-1的表达，而ADSCs可以通过旁分泌机制并上调Glut-2和Pdx-1的表达对胰岛细胞起到保护作用。

二甲双胍联合吡格列酮干预对精神分裂症合并2型糖尿病患者体脂成分及α、β细胞功能的影响

【目的】探讨二甲双胍联合吡格列酮对精神分裂症（SP）合并2型糖尿病（T2DM）患者体脂成分及α、β细胞功能的影响。【方法】选择2015年1月至2016年6月本院收治的SP合并T2DM患者180例,按照随机数表法分为对照组与观察组,每组90例。两组均予常规基础治疗,对照组采用二甲双胍治疗,观察组采用二甲双胍加用吡格列酮治疗,比较两组治疗效果、治疗前后糖代谢、体脂成分、α、β细胞功能的变化及不良反应发生率。【结果】①治疗后,两组空腹血糖（FPG）、餐后2h血糖（2hPG）、糖化血红蛋白（HbA1c）均降低（P〈0.05）,观察组2hPG降低幅度高于对照组（P〈0.05）。②治疗后,两组胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）降低、胰岛素分泌指数（HOMA-β）上升（P〈0.05）,观察组HOMA-β高于对照组,HOMA-IR、胰高血糖素水平低于对照组（P〈0.05）。③治疗后,两组总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）均降低,三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）上升（P〈0.05）,观察组治疗后TC、LDL-C均低于对照组（P〈0.05）。④治疗后,观察组体质量、体脂率（BF）均低于对照组（P〈0.05）,两组不良反应发生率比较差异无统计学意义（P〉0.05）。【结论】SP合并T2DM患者体脂率上升,胰岛α、β细胞功能降低,早期采用二甲双胍联合吡格列酮干预,可改善患者体脂成分,优化胰岛α、β细胞功能。

两种不同胰岛素强化治疗方法对新诊断2型糖尿病患者胰岛β细胞功能的影响

【目的】比较持续皮下胰岛素输注（CSⅡ）和多次胰岛素皮下注射（MSⅡ）在2型糖尿病强化降糖中的效果。【方法】60例新诊断2型糖尿病病人，分成胰岛素泵治疗组24例（CSⅡ组）和皮下注射胰岛素组36例（MSⅡ组），治疗2周，观察两组治疗前后空腹及餐后血糖、胰岛素、C肽变化，比较两组血糖达标天数、最大胰岛素用量、平均胰岛素用量及低血糖现象发生情况。【结果】治疗后两组血糖均有明显下降（P〈0．05），胰岛素及C肽水平较治疗前明显升高（P〈0．05），两组治疗后上述改变无明显统计学差异（P〉0．05）。但CSⅡ组血糖达标时间较MSⅡ组短，平均胰岛素用量及最大胰岛素用量均较MSⅡ组少，且低血糖发生次数也较MSⅡ组少，差异均有统计学意义（P〈0．05）。【结论】CSⅡ和MSⅡ两种治疗方法均可有效降低2型糖尿病患者血糖，改善胰岛β细胞分泌功能，对初发的2型糖尿病有良好治疗效果，其中胰岛素泵可以缩短血糖达标天数，减少胰岛素用量，降低低血糖发生率，有一定优势。

TNF-α、IL-6和CRP对哮喘病人胰岛β细胞功能的影响

目的 探讨哮喘病人血清炎症因子TNF-α、IL-6和C-反应蛋白（CRP）对胰岛β细胞功能的影响.方法 选择慢性持续期哮喘病人112例,根据哮喘病情严重程度分为轻度持续组（55例）和中度持续组（57例）两组,健康志愿者60例为对照组.分别测定血清TNF-α、IL-6及CRP水平,同时做葡萄糖耐量及胰岛素释放试验,计算胰岛素曲线下面积（AUC1）和葡萄糖曲线下面积（AUCG）的比值（AUC1/AUCG）、HOMA胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）、胰岛素敏感指数（IS1）、HOMA-β细胞功能指数（HBCI）、早期胰岛素分泌功能指数（△130/△G30）.做肺功能检查,测定第1秒用力呼气容积（FEV1）和用力肺活量（FVC）.结果 与对照组比较,轻、中度持续组哮喘病人血浆TNF-α、IL-6、CRP水平明显升高,AUC1、AUC1/AUCG、HOMA-1R、HBCI明显升高,ISI下降（t=2.02～13.62,P＜0.05）.多因素逐步回归分析显示HOMA-IR与CRP、LDL-C、BMI、AUC1、TNF-α呈正相关（P＜0.01或P＜0.05）,与FEV1占预计值（%）呈负相关（P＜0.05）.结论 哮喘病人存在胰岛素抵抗和高胰岛素血症,TNF-α、IL-6和CRP参与了胰岛素抵抗.

FoxO1因子与β细胞去分化的关系

2型糖尿病是由于β细胞功能缺陷导致不同程度的胰岛素缺乏和组织胰岛素抵抗的慢性代谢性疾病.β细胞功能下降是2型糖尿病进展的中心环节,而胰岛β细胞去分化作为胰岛功能减退的重要机制之一,近年有研究显示,叉头转录因子O亚组1(FoxO1)活性下降与β细胞去分化密切相关.研究FoxO1参与β细胞去分化的具体发生机制并促进去分化的β细胞再分化将会为2型糖尿病的预防和治疗提供新的思路.