去细胞处理对牛颈静脉带瓣管道细胞外基质骨架的影响

目的:探讨去细胞处理对牛颈静脉带瓣管道细胞外基质骨架成分及组织稳定性的影响,为确立构建组织工程化的人工血管技术提供依据。方法:采集新鲜牛颈静脉,筛选瓣膜功能良好的血管,采用曲那通X-100、胰蛋白酶/EDTA和DNase-I/RNase-A三步法去细胞处理,组织化学染色和透射电镜观察细胞外基质骨架成分(胶原和弹力蛋白)的变化。对新鲜和去细胞处理的牛颈静脉血管壁(n=10)分别进行弹力蛋白(Fastin弹性蛋白法)和羟脯氨酸(碱水解、分光光度法)含量测定;并测定处理前后的热皱缩温度和抗张强度以比较组织稳定性。结果:去细胞处理牛颈静脉血管壁光镜和透射电镜检测提示细胞及其成分完全去除,组织间隙增宽,但胶原成分较好保留,弹力蛋白部分减少及断裂。与新鲜组织比较,去细胞组羟脯氨酸含量相对增加[(25.73±2.97)mg/gvs.(29.25±2.99)mg/g,P<0.05],弹力蛋白含量相对减少[(159.71±21.06)mg/gvs.(134.91±35.40)mg/g,P<0.05],热皱缩温度降低[(72.50±0.53)℃vs.(69.75±0.54)℃,P<0.05],抗张强度也下降明显[(5.19±0.65)MPavs.(3.13±0.94)MPa,P<0.05]。结论:去细胞处理对牛颈静脉细胞外基质骨架有一定损害,牛颈静脉的组织稳定性有所下降,得到的细胞外基质基本成分需经进一步交联处理才可以作为组织工程支架材料。

牛颈静脉带瓣管道重建犬右心室流出道的血流动力学研究

目的 观察自制牛颈静脉带瓣管道重建犬右心室流出道后的血流动力学性能。 方法 应用经戊二醛处理的牛颈静脉带瓣管道对 7只犬行肺动脉与右心室连接 ,重建右心室流出道前后测定肺血流动力学 ,行超声心动图检查牛颈静脉带瓣管道通畅情况。 结果 重建术后 1年 7只犬均存活。重建右心室流出道前后肺动脉收缩压、舒张压和平均压均无明显改变 ,右心室舒张压无明显变化 ,收缩压和平均压显著增加 (P<0 .0 1)。术后超声心动图检查瓣膜关闭良好 ,无明显反流 ,跨瓣压差小 ;术后 1年超声心动图检测发现全部带瓣管道通畅 ,未见明显血栓形成 ,除 1只犬瓣叶活动稍差合并轻度反流外 ,其余犬瓣叶活动良好。心导管测压显示肺动脉与右心室之间压差为 3～ 19mm Hg(1k Pa=7.5 mm Hg) ,管道内舒张压显著高于右心室舒张压 ,右心室造影显示牛颈静脉带瓣管道和肺动脉无明显梗阻。

彩色多普勒超声心动图检测牛颈静脉带瓣管道重建犬右室流出道后结构及血流动力学研究

目的:采用彩色多普勒超声心动图(echocardiography,UCG)观察牛颈静脉带瓣管道重建犬右室流出道(right ventricular outflow tract,RVOT)后心血管结构和血流动力学变化。方法:应用牛颈静脉带瓣管道(valved bovine jugular vein conduit,BJVC)重建犬右室流出道,分三阶段,共32只实验犬。应用UCG在术后、术后7d和1年后观察右心室与肺动脉结构状况,测定重建后BJVC各截面的直径、右心室和肺动脉端吻合口的宽度、血流速度(V)和压差(pressure gradient,PG),并评价BJVC通畅情况。结果:第一阶段,5只犬术后彩色多普勒超声心动图检测犬右心室与BJVC重建的右室流出道(right ventricularoutflow tract,RVOT)吻合口部分存在的压差稍大,吻合口普遍偏小;部分犬BJVC远端与肺动脉主干吻合处表现出吻合口偏小,血流经过流速加快,压差增高,彩色多普勒血流呈五彩镶嵌。第二阶段,重建术后1年7只犬均存活,术后UCG检查瓣膜关闭良好,无明显返流,跨瓣压差小;带瓣管道通畅,未见血栓形成图像,除1只犬瓣叶活动稍差外,其余犬瓣叶活动良好。第三阶段,共观察20例,术后、术后7d和1年UCG检测示带瓣管道通畅,瓣膜关闭良好,右室与BJVC吻合口及远端吻合口通畅,周边无渗漏,无明显返流或湍流图像,跨瓣压差小,未见明显新生物图像。结论:UCG能定性、定量观察和评价BJVC重建犬RVOT的结构和血流动力学变化,可以正确评价其术后疗效,对BJVC的研制和临床应用具有重要价值。

戊二醛鞣制的牛颈静脉带瓣管道钙化的实验研究

目的探讨戊二醛鞣制的牛颈静脉带瓣管道是否易于钙化。方法本研究以戊二醛鞣制的牛颈静脉作为研究对象,通过建立大鼠皮下包埋动物模型11例加速体内钙化的方法,应用原子吸收光谱法测定组织钙含量。结果血管壁和瓣膜钙含量分别为(211.00±25.83)μg/m g和(4.218±3.879)μg/m g,后者为前者的2%,统计学上差异有显著性(P<0.001)。结论戊二醛交联鞣制的牛颈静脉血管壁较易发生钙化,与之相比瓣膜较不易钙化。

光交联剂SANPAH在处理后的牛颈静脉血管表面接枝生物短肽RGD

目的:通过不同摩尔浓度、摩尔比的光交联剂SANPAH和RGD接枝于经过去细胞和光氧化后的牛颈静脉(BJVC)表面的初步研究,以明确接枝RGD的效果和最佳浓度。方法:分别取4个不同浓度的SANPAH和RGD进行3个摩尔比的反应,经过紫外线照射光化学接枝后,各组血管片进行快速冰冻切片,荧光显微镜下观察,看不同浓度下和摩尔比反应、结合的荧光效果,从而初步推断出最佳的反应和结合浓度。结果:应用光交联剂后,血管内膜面有一层较强的荧光,随着RGD和SANPAH的浓度的升高,荧光整体上是越来越强,但是二者的浓度高于0．6mM时,荧光差别不是很明显;当二者的反应摩尔比为1:1时,荧光最强。结论:光交联剂SANPAH能够把RGD接枝到BJVC上,最佳的RGD和SANPAH反应及接枝的浓度是0．6mM,最佳的摩尔比是1:1。

光氧化处理牛颈静脉带瓣管道重建肺动脉与右心室连接

目的 观察光氧化处理的牛颈静脉带瓣管道用于重建右心室—肺动脉连接后，在体内循环系统中与血流接触条件下的抗钙化性能及其血流动力学性能。方法 以经光氧化反应处理的牛颈静脉带辩管道为研究时象，以单纯戊二醛交联固定的牛颈静脉带瓣管道作为对照，建立犬重建右心室—肺动脉连接的动物模型；实验动物饲养观察10个月后，通过超声心动图和心导管检查等方法评价两种不同方法固定处理的牛颈静脉带瓣管道重建犬右心室—肺动脉连接后的血流动力学性能，并了解牛颈静脉管道内的瓣膜在犬的右心系统内的功能。屠宰实验动物后取出标本，通过原子吸收光谱法测定组织钙含量，von Kossa钙盐染色观察组织钙化情况。结果 心脏超声显示两组管道均通畅，瓣叶活动良好。光氧化处理组结扎肺动脉前、后直接测压及术后9-10个月通过心导管测压，所测得的跨瓣压差维持在较低水平，跨瓣压差无明显升高；戊二醛组结扎肺动脉前、后及术后9—10个月测得的跨瓣压差与光氧化组相似。光氧化组管道血管壁钙含量为7．60±8．02mg／g，戊二醛组管道血管壁钙含量为丝，05±10．78mg/g，两组有显著性差异（P〈0．05）；光氧化组和戊二醛组管道瓣膜钙含量分别为0．74±0．23mg/g和0．88±0．69mg／g，两组相比无统计学差异（P〉0．05）。结论 光氧化反应处理固定的牛颈静脉带瓣管道可用于重建右心室—肺动脉连接，血流动力性能良好，与自体肺动脉相当，远期血流动力学性能尚待进一步观察研究。光氧化反应处理固定的牛颈静脉带瓣管道在狗的动物模型中，抗钙化性能优于戊二醛固定的牛颈静脉管道。

用牛颈静脉制备婴儿右心流出道修复材料及活体研究的初步报告

目的证明牛颈静脉可作为制备婴儿右心流出道的修复材料。方法分别用4 %的EX -313与0.5 %的戊二醛处理牛颈静脉带瓣胶元管道 ,所获材料进行外观、瓣膜功能、扫描电镜与光镜检查 ,及生物力学的测试并进行犬肺动脉成型与重建的活体观察。所获的数据进行t检验。结果证明EX -313及内壁肝素化处理后的材料较单纯戊二醛处理者的质地更接近天然血管 ,结构间充满空隙 ,抗张强度与戊二醛处理者相当 ;抗钙化与抗栓方面明显优于戊二醛处理者。结论经亲水性交联剂EX_313处理的牛颈静脉有可能成为较理想的婴儿用右心流出道修复材料。

Triton X-100、环氧氯丙烷联合改性处理牛颈静脉带瓣管道的体内外生物相容性研究

目的评价Triton X-100、环氧氯丙烷联合改性处理戊二醛固定的牛颈静脉带瓣管道的体内外生物相容性。方法取新鲜牛颈静脉,热缺血时间在2 h以内,依次经戊二醛、Triton X-100、环氧氯丙烷交联处理,制备出新型抗钙化牛颈静脉带瓣管道(EC+Tr组);以单纯戊二醛处理的牛颈静脉为对照(GA组),参照国家植入材料的检验标准,采用处理后牛颈静脉材料浸提液进行溶血试验、皮内注射刺激试验、急性全身毒性试验和细胞毒性试验。结果溶血试验中,EC+Tr组溶血率为2.6%,小于GA组3.7%的溶血率(P<0.05),符合国家标准(<5%);皮内刺激试验中,EC+Tr组PI(I原发性刺激指数)为0.5,小于GA组的0.87,提示对受试动物皮肤刺激轻微;急性全身毒性试验中,受试动物均未出现毒性症状;细胞毒性试验中,EC+Tr组培养的L-929小鼠成纤维细胞经100%浓度材料浸提液处理后形态良好,增殖率达87.55%,毒性评级为1级(合格),优于GA组结果(增值率为69.47%,毒性评级为2级,P<0.05)。结论 Triton X-100、环氧氯丙烷联合改性处理戊二醛固定的牛颈静脉带瓣管道符合国家标准,具有良好的生物相容性,为进一步临床应用提供了理论依据。

牛颈静脉组织工程带瓣管道实验研究

目的:培养犬骨髓间充质干细胞,标记后种植于去细胞牛颈静脉,构建组织工程带瓣管道。方法:去除牛颈静脉细胞作为支架材料,评价去细胞效果。分离、培养和扩增犬骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为种子细胞,体外再细胞化牛颈静脉,构建组织工程带瓣管道。结果:去细胞处理后,牛颈静脉瓣叶及血管壁内皮细胞、成纤维细胞去除完全,细胞外基质纤维呈波浪状排列整齐,结构完整。由犬骨髓分离出的BMSCs,SH2、Vimentin、α-SMA呈阳性;对CD34、Ⅷ因子、Laminin呈阴性,能满足组织工程种子细胞的需求。采用Hoechst荧光标记的种子细胞,可传入子代细胞,其荧光亮度无明显衰减。种子细胞种植7d后,细胞已经贴附于去细胞牛颈静脉上,部分深入到瓣叶支架内部。结论:犬骨髓间充质干细胞Hoechst标记后种植于去细胞牛颈静脉,构建组织工程带瓣管道,方法简单、可行。

应用生物材料重建上腔静脉

目的:探讨胸部肿瘤手术中上腔静脉及其属支切除后生物材料重建上腔静脉的方法和效果。方法:2003年5月到2005年12月,11例累及上腔静脉及其属支的胸部肿瘤病人使用牛颈静脉或自体心包重建上腔静脉。手术置换血管前后中心静脉压予以连续测定,并随访病人治疗结果。结果:重建生物血管12根,其中牛颈静脉7根,自体心包缝制管道5根,一例同时应用了牛颈静脉与自体心包管道。手术前中心静脉压偏高[(26．2±2．8)cmH_2O,n=11],手术重建上腔静脉后略有降低[(20．8±2．0)cmH_2O,与手术前比较,P＜0．05],手术后48小时已经降低到接近正常范围[(13．5±1．9)cmH_2O,与手术前比较,P＜0．05]。手术中无死亡,1例术后发生肺部感染最后致呼吸衰竭,5周后死亡,其余病人均度过围手术期。2例分别于术后7个月和11个月死于原发肿瘤复发,一例术后一年发现有脊柱转移,目前带瘤生存,余7例病人目前无复发迹象。结论:牛颈静脉或自体心包可以作为一种可以接受的上腔静脉重建替换材料。

医用牛颈静脉带瓣管道重建右室流出道临床应用研究

目的应用牛颈静脉带瓣管道（BJVC）进行心脏右室流出道的重建，探讨BJVC对复杂先天性心脏病外科治疗的效果。方法2005年10月至2009年5月共应用BJVC治疗复杂先天性心脏病15例。结果BJVC重建右室流出道15例患者均痊愈出院。随访3～24个月，患者心悸、气促消失，活动耐力明显提高，心功能恢复至I～Ⅱ级，超声检测发现15例置入的管道通畅，无扩张，未见血栓形成，瓣叶活动良好，无明显反流，肺动脉跨瓣压差不大，吻合口无狭窄。结论BJVC用于复杂先天性心脏病右室流出道的重建可获良好的近期治疗效果，但远期效果仍有待进一步观察。

戊二醛鞣制VBJVC流体动力学的体外实验研究

目的体外测试戊二醛(GA)鞣制牛颈外静脉带瓣管道(VBJVC)流体动力学的相关特性。方法用自行制作的流体动力学测量仪,对20根经GA鞣制的VBJVC进行逆瓣膜及顺瓣膜灌流量测定,测量跨瓣压差及瓣膜管道逆行加压实验。并用光镜检查管道及瓣膜形态结构改变。结果 (1)逆/顺行灌流量百分比(P)。分为3组:A组(P<20%)11根;B组(20%≤P≤50%)5根;C组(P>50%)4根。(2)跨瓣膜压差很小,为0～1 mm Hg。(3)逆行加压实验,光镜检查未发现瓣膜及管壁损伤,上皮细胞、纤维细胞、胶原纤维及弹力纤维均完整无损。(4)瓣膜抗反流功能与瓣叶高度和瓣窦高度之比呈正相关(P<0.01)。结论经GA鞣制的VBJVC抗反流能力与瓣叶高度和瓣窦高度之比呈正相关。瓣膜开放功能好。逆行加压试验显示瓣膜及管道结构无损伤。

牛颈静脉带瓣管道重建犬右室-肺动脉连接后的钙化研究

目的研究牛颈静脉用于重建右室-肺动脉连接后的钙化情况。方法以戊二醛鞣制的牛颈静脉带瓣管道为研究对象,建立犬重建右心室-肺动脉连接动物模型,观察9￣10个月,通过原子光谱吸收法测定组织钙含量,以评价在体内循环系统中与血流接触的情况下,牛颈静脉带瓣管道的钙化情况。结果管壁钙含量为(22.05±10.78)μg/mg,瓣膜钙含量为(0.88±0.69)μg/mg,后者仅为前者的3.99%,经配对t检验分析,在统计学上差异均有显著性(P<0.001)。瓣下管壁钙含量为(16.04±4.25)μg/mg,瓣上管壁钙含量为(28.07±17.98)μg/mg,配对t检验显示二者在统计学上差异无显著性(P>0.05);瓣膜的基底部、交界部及游离缘3者之间的钙含量在统计学均无显著性差异,配对t检验显示P>0.05;结论牛颈静脉带瓣管道重建右室-肺动脉连接后,血管壁远较瓣膜容易钙化;瓣上管壁和瓣下管壁钙化程度无明显差异,瓣膜各部分钙化程度无明显差异。

染料介导光氧化处理去细胞牛颈静脉带瓣管道的细胞毒性研究

目的：评价染料亚甲基蓝介导的光氧化处理去细胞牛颈静脉带瓣管道的细胞毒性。方法：（1）间接接触毒性试验：制备染料介导光氧化处理去细胞牛颈静脉带瓣管道浸提液，培养I．929细胞，然后采用MTT比色法测定相对增殖率。（2）直接接触毒性试验：将L929细胞与染料介导光氧化处理去细胞牛颈静脉带瓣管道直接接触培养，在不同时间观察细胞的生长状态。将L929细胞种植于染料介导光氧化处理去细胞牛颈静脉带瓣管道表面，用扫描电镜观察其生长情况。结果：染料亚甲基蓝介导光氧化处理去细胞牛颈静脉带瓣管道的性质稳定，细胞毒性程度为0～1级。L929细胞与瓣膜材料直接接触培养生长良好，形态学无明显改变。结论：染料介导光氧化处理去细胞牛颈静脉带瓣管道的细胞相容性良好。

异种牛颈静脉带瓣管道重建右室流出道的实验研究

目的观察去细胞牛颈静脉带瓣管道(B JVC)重建猪右心室流出道后的血流动力学。方法应用经去细胞(B组)及未去细胞(A组)的牛颈静脉带瓣管道分别进行猪肺动脉与右心室连接,行超声心动图检测牛颈静脉带瓣管道血流动力学参数。结果重建术后3个月16头猪均存活。A组及B组牛颈静脉近端及远端吻合口口径、牛颈静脉反流量差异无统计学意义,A组近端及远端吻合口压差、跨瓣压差大于B组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论去细胞化的牛颈静脉可能是一种更好的重建右室流道材料,但远期效果需进一步研究。

用牛颈静脉制备抗栓 抗钙化性右心流出道修复材料的实验研究

目的论证用牛颈静脉制备抗栓、抗钙化右心流出道修复材料的可行性。方法用EX-313交联牛颈静脉带瓣胶原管道并用肝素处理其内壁,裁成带单瓣的补片,用其扩大7条犬的肺动脉,同时建立用戊二醛制成的补片扩大肺动脉对照模型。在6个月内观察补片的抗栓、抗钙化、内皮化及组织重构的情况。结果在抗栓、抗钙化、内皮化及组织重构方面EX-313及肝素处理的牛颈静脉明显优于戊二醛处理者。结论经亲水性交联剂EX-313及肝素处理内壁的牛颈静脉有可能成为制作重建右心流出道的基本材料,在进一步研究的基础上它也可能成为组织工程带瓣管道的支架材料。

去细胞带瓣牛颈静脉管道支架的制备及形态结构观察

目的研究去细胞带瓣牛颈静脉组织工程支架的制备,并观察其形态结构。方法取新鲜牛颈静脉48条,随机分为对照组、实验组,每组24条。对照组为新鲜牛颈静脉;实验组为去细胞牛颈静脉,用40 g/L脱氧胆酸钠+50 m l/L Triton-X-100为主要成分的试剂进行处理,去除内皮细胞及成纤维细胞。HE染色、苦味酸-天狼猩红染色、弹力纤维染色、电子扫描显微镜检查、基因组DNA检测,观察其形态结构,评价去细胞效果。结果实验组瓣膜及血管壁中内皮细胞、成纤维细胞去除完全,无细胞核碎片;瓣膜及血管壁胶原纤维和弹力纤维呈波浪状排列、整齐,结构完整;瓣膜、血管壁基因组DNA含量,分别较对照组下降97.58%、97.25%。结论脱氧胆酸钠+Triton-X-100是一种有效的去除牛颈静脉细胞,制备组织工程带瓣管道支架的方法。

戊二醛结合肝素鞣制牛颈静脉带瓣管道抗钙化的实验研究

目的用动物皮下包埋的模型,用戊二醛鞣制的牛颈静脉带瓣管道(VBJVC)作为对照,来研究戊二醛结合肝素鞣制的牛颈静脉带瓣管道是否具有更好的抗钙化能力和抗衰老能力。方法把牛颈静脉带瓣管道分为两组,实验组(戊二醛结合肝素组)和对照组(戊二醛组),分别包埋在两组实验兔的皮下。90d后取出牛颈静脉带瓣管道片,进行钙的定量分析和形态学检查。形态学分析包括光镜下HE染色和Von-Kossa染色,进行钙化程度的比较。结果比较戊二醛结合肝素鞣制的VBJVC(A组)较之传统的单纯的用戊二醛鞣制的VBJVC(B组),其结果有明显的统计学意义。(1)标本用原子分光光度计测量组织钙含量,A组(13.92±5.03)mg/g,B组(34.99±12.33)mg/g,A组的组织钙化明显低于B组;(2)光镜下用Von-Kossa钙染色,按照Carpentier的分级方法,A组,0度2个,Ⅰ度3个,Ⅱ度1个。B组,0度1个,Ⅰ度1个,Ⅱ度2个,Ⅲ度2个,A组的组织钙化明显低于B组。结论经过戊二醛结合肝素鞣制的VBJVC,较之单纯用戊二醛鞣制的VBJVC,有较好的抗钙化能力。

环氧氯丙烷处理牛颈静脉带瓣管道生物学特性的研究

目的评价环氧氯丙烷处理牛颈静脉带瓣管道(BJVC)的生物学特性。方法分别比较戊二醛处理、环氧氯丙烷处理、戊二醛+环氧氯丙烷联合处理和新鲜BJVC的管壁、瓣膜的厚度、大体形态、组织学特点、含水量、热皱缩温度及断裂强度,并进行可溶性蛋白含量的测定。结果戊二醛+环氧氯丙烷联合处理组BJVC的管壁、瓣膜厚度、组织含水量与未处理组相比较无明显变化;但管壁、瓣膜断裂强度和热皱缩温度均较新鲜对照组明显提高(P<0.05),可溶性蛋白的含量明显减少(P<0.05)。结论戊二醛+环氧氯丙烷联合处理的带瓣管道材料具有较好的生物学特性。

3种血管替代物植入人体后的变化及比较分析

目的:了解临床上3种常用血管替代物人体内移植后的变化。方法:临床获取因治疗需要而取出的先天性心脏病患儿早期植入的Gore-Tex管道、牛颈静脉管道和同种带瓣管道标本,通过对大体标本观察,组织学切片HE染色、Masson染色、Verhoeff弹性纤维染色以及特异性细胞标记物(α-SMA、calponin、VE-cadherin)免疫组织化学染色,评价移植物植入人体后的变化。结果:Gore-Tex管道移植后原管道未降解,管道壁中无细胞长入,管腔内形成假膜,其中假膜富含胶原纤维,无弹性纤维,散在α-SMA+细胞和calponin+细胞。牛颈静脉管道移植后,原管道未降解,管道壁中无细胞长入,管腔内可见假膜,假膜较厚,富含胶原纤维,但存在特殊排列的弹性纤维,弹性纤维所在区域聚集α-SMA+细胞和calponin+细胞。同种带瓣管道移植后,管道近乎全层钙化,仅残留浅薄的内膜,内膜表面光滑,无假膜形成,可见VE-cadherin+内皮细胞层及残存的平滑肌细胞。结论:Gore-Tex管道和牛颈静脉管道难以降解,且不具备生长性,远期易出现管道狭窄;同种带瓣管道移植后无假膜形成,但易出现钙化,限制了管道的使用寿命。