K88和K99双价基因工程菌C株与E株表达效果的比较

应用ＬＢ培养基３７℃、１５０ｒ／ｍｉｎ振荡培养１７小时，室温４０００ｒ／ｍｉｎ，离心３０分钟，收集沉淀菌体，用ＰＢＳ离心洗涤一次，沉淀物重悬于适量的ＰＢＳ中。三等分菌体悬浮液分别用超声波、冻融、热休克等方法处理后，室温８０００ｒ／ｍｉｎ离心３０分钟，取上清液加入饱和硫酸铵４℃过夜，沉淀蛋白经透析，ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１５０过柱纯化。应用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、凝胶扫描测定Ｋ８８、Ｋ９９蛋白的分子量及浓度，双向免疫扩散、ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ试验测定其抗原性。结果表明，热休克法分离纤毛抗原是最好的方法，从Ｃ株Ｅ株分离得到的纤毛抗原，在分子量大小及对单抗亲和反应能力方面没有明显的差异。

产毒素大肠杆菌LTB-K99融合基因的构建

利用PCR技术从原始菌种中扩增得到K99和LTB基因,将K99和LTB基因连接起来,构建了LTB-K99融合基因。融合基因克隆到pBS-T载体上,转化大肠杆菌top10,经Bam HI和Xho I双酶切鉴定重组质粒。测序分析结果表明,该融合基因有正确的阅读框,为以后转入表达载体的构建奠定了基础。