人细胞角蛋白Keratin 14的生物信息学分析

人细胞角蛋白Keratin 14是I型中间丝蛋白家族的亚群,参与形成上皮细胞的细胞骨架。利用生物信息学分析Keratin 14基因的启动子区、CpG岛及其所编码的蛋白质的理化性质、结构特点和功能特征。结果表明,Keratin 14基因存在两个启动子区,启动子区不存在CpG岛;Keratin 14全长472个氨基酸,其等电点为5.09,是一个无跨膜结构的亲水性蛋白质;角蛋白Keratin 14二级结构具7个α螺旋和5个β折叠,预测三级结构的拉曼图分析显示其结构稳定;与Keratin 14相互作用的蛋白质主要是角蛋白,而且Keratin 14还参与细胞的生长和分裂,有促进细胞分化的作用;此外,Keratin 14的氨基酸序列在哺乳动物间的同源性较高。上述对角蛋白Keratin 14的表达、结构和功能的预测可以为研究其在生命过程中的作用提供重要的信息。

角蛋白14突变导致Dowling-Meara亚型单纯型大疱性表皮松解症伴色素沉着

目的:检测Dowling-Meara亚型单纯型大疱性表皮松解症(DM-EBS)伴色素沉着一家系的基因突变。方法:收集DMEBS患儿临床资料;取皮损行透射电镜检查;应用PCR及DNA直接测序的方法,检测该家系成员角蛋白(KRT)5和KRT14基因的全部编码序列,并与正常序列进行对比。结果:透射电镜检查可见基底细胞下部裂隙形成,张力微丝呈团块状。患儿KRT14基因第1号外显子中的第373位碱基发生C→T杂合突变(c.C373 T),导致其编码的KRT14 1A螺旋段第125位氨基酸发生错义突变(p.R125C),患儿父母未发现该突变。结论:KRT14基因的R125C突变可能为引起该患儿临床表型的病因,推测认为该突变不仅可引起表皮松解,还可造成皮肤色素沉着。

血浆角蛋白-14水平对急性呼吸窘迫综合征患者的临床指导意义

[摘要]目的探讨血浆中角蛋白-14（KRT-14）表达水平对急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者的临床意义。方法采用前瞻性观察性临床研究方法，选择临床诊断的52例ARDS患者，以同期20例非ARDS患者为对照组。于患者入院后24h内记录急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ（APACHEⅡ）评分和氧合指数（PaO2／FiO2），测定血KRT-14、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、降钙素原（PCT）、C反应蛋白（CRP）水平，入院后第7天测定随机抽取的18例患者血浆KRT-14。结果与非ARDS组比较，ARDS组APACHE肼分和病死率增高，PaO2／FiO2降低，血浆各血清学指标水平升高。血浆KRT-14、IL-6、CRP随病情的加重升高。血浆KRT-14与PaO2／FiO2呈负相关（r=-0．548，P=0．00），入院24h内血浆KRT-14水平升高（OR=0．007，95％C10．000～0．319，P=0．011）是患者死亡的独立危险因素，死亡患者入院后的血浆KRT-14水平明显高于生存患者。KRT-14预测ARDS的ROC曲线下面积为0．97，在最佳临界值为3．52μg／L时，其特异度为90．0％，敏感度为96．2％。ARDS患者的血浆KRT-14水平高于普通肺炎患者及健康人。结论血浆KRT-14是肺损伤程度的重要标志物，可作为临床预测和评估ARDS的辅助指标。

角蛋白14在胎儿表皮发育中表达的研究

目的 了解角蛋白 14 (K14 )在人胎儿表皮发育中的变化及意义。方法 早、中、晚期胎儿皮肤做冰冻切片 ,进行K14的免疫细胞化学染色 (Immunocytochemistry ,ICC)和原位杂交染色 (insituhybridization ,ISH) ,通过图像分析和统计学处理分析K14的变化及规律。结果 人胚胎 12周表皮已表达K14 ,中期表达量最高 ,晚期也有较高表达 ,但主要局限于表皮基底层细胞。结论 胎儿表皮基底层角朊细胞 (KC)表达K14 ,对维持KC形态 。

抗角蛋白14单克隆抗体对无血清培养角质形成细胞增殖的影响

目的:建立一种无血清传代培养人角质形成细胞(KC)的方法,并观察角蛋白14单克隆抗体(anti-K14 mAb)对无血清培养人角质形成细胞体外增殖的影响。方法:应用角质形成细胞无血清培养基(KC-SFM)添加重组表皮生长因子(EGF)和牛垂体浸出液(BPE)传代培养角质形成细胞,培养均至第3代时于培养基中加人不同浓度的anti-K14 mAb,用MTT法观察对角质形成细胞增殖的影响。结果:应用无血清培养基成功地传代培养了角质形成细胞,MTT法结果显示各浓度组对培养的角质形成细胞的增殖有显著抑制作用并有浓度依赖性。结论:建立了一种无血清培养人角质形成细胞的方法a,nti-K14mAb对人角质形成细胞体外的增殖有显著抑制作用。

大鼠生后发育期皮肤和毛囊中角蛋白14的研究

目的 研究大鼠新生和幼年期的皮肤和毛囊中角蛋白 14的mRNA的分布和含量的变化。方法 生后第 1至 49天Wistar大鼠分为 3 2组 ,测定毛发周期 ,并用放射标记的原位杂交方法 (insituhybridization ,ISH)对皮肤和毛囊石蜡切片上角蛋白 14mRNA的分布进行了研究和半定量分析。结果 大鼠的第 1毛发周期明显短于第 2周期 ,和小鼠同期相比也有差别 ;角蛋白 14mRNA主要见于表皮基底 基上层和毛囊上部外根鞘等部位的角质形成细胞及皮脂腺细胞等 ,其他区域及细胞无角蛋白 14mRNA阳性信号检见。结论 大鼠新生和幼年期皮肤和毛囊中角蛋白 14mRNA的表达与在成人和人胚胎皮肤中的规律有一定差异。

KRT14分子诊断中两种去除假基因干扰的扩增方法比较

目的已报道有3种方法可以去除KRT14P对于KRT14分子诊断的干扰,分别为从活检组织中提取RNA法、用识别KRT14P的限制性内切酶酶切基因组DNA法和长距离特异性扩增KRT14法。本文建立特异性扩增法并和内切酶法就能否完全去除假基因干扰做比较。方法据文献报道KRT14P外显子2上有AluI的酶切位点而KRT14外显子2上没有该位点,用AluI消化基因组DNA。部分消化和完全消化的酶切产物作为模板用于下一步KRT14的分子诊断。比对KRT14和KRT14P的区别,设计特殊引物对使其包括3′末端的碱基和KRT14P错配而和KRT14完全匹配,这些引物对在PCR过程中将只扩增KRT14而去除假基因的干扰。结果部分酶切消化的基因组DNA因为不能完全去除KRT14P可能导致假阳性结果。应用本文中的特殊引物对,能够很好地去除KRT14P的干扰。结论我们采用的特异性扩增法去除KRT14P较酶切法经济有效。

成束蛋白1和角蛋白14表达与T1期胃癌伴淋巴结转移的相关性研究

目的探讨消化内镜检查组织成束蛋白1(FSCN1)和角蛋白14(KRT14)表达与T1期胃癌伴淋巴结转移的相关性。方法选择确诊为T1期胃癌患者120例,其中伴淋巴结转移50例为观察组,未发生淋巴结转移70例为对照组。采用免疫组化染色检测组织FSCN1和KRT14阳性表达率,Western-blot法检测组织FSCN1和KRT14相对表达量。结果观察组肿瘤组织FSCN1和KRT14阳性表达率和相对表达量均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。组织FSCN1和KRT14表达与肿瘤的分化级别有显著相关性(P<0.05)。结论FSCN1和KRT14表达与早期胃癌的发生和淋巴结转移相关。

皮肤组织特异性表达hCTLA4-Ig转基因小鼠品系的建立

为研究皮肤特异性高效表达hCTLA4-Ig分子对移植皮肤存活及受体免疫功能的影响,充分实现hCTLA4-Ig分子在皮肤移植中的免疫调控功能,利用K14(角蛋白14)基因启动子,构建了hCTLA4-Ig分子皮肤组织特异性表达载体,并通过受精卵原核显微注射技术制备了K14/hCTLA4-Ig转基因小鼠并建立了品系。通过RT-PCR和Northernblot分析表明,hCTLA4-Ig在转基因小鼠体内呈皮肤组织特异性高效表达;以GAPDH基因的表达量为内部参照分析表明,hCTLA4-Ig的表达水平在不同世代之间以及转基因个体的不同生命时相点之间保持相对恒定,说明皮肤组织特异性稳定表达hCTLA4-Ig的转基因小鼠品系已被建立。

亚油酸对角质形成细胞屏障相关蛋白表达的影响

目的:检测亚油酸对角质形成细胞屏障相关蛋白Filaggrin、keratin-14和claudin-1表达的影响。方法:选用不同浓度的亚油酸(2 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL)刺激人角质形成细胞,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞存活率,并绘制细胞生存/抑制曲线;qRT-PCR和Western blot分别检测不同浓度亚油酸刺激后角质形成细胞Filaggrin、keratin-14和claudin-1的mRNA及蛋白水平的变化。结果:角质形成细胞生存率随亚油酸样品浓度升高而降低。角质形成细胞中Filaggrin和keratin-14的表达随着亚油酸样品浓度升高表达明显增加。claudin-1表达在2 ng/mL和10 ng/mL亚油酸作用下明显增加,而在20 ng/mL浓度下,claudin-1表达下降。结论:在2 ng/mL和10 ng/mL亚油酸作用下,Filaggrin、keratin-14和claudin-1表达随着亚油酸作用浓度升高而增加。

全身性过表达和表皮特异性过表达胸腺素β4小鼠皮肤中目的基因表达差异分析

胸腺素β4(Thymosinβ4,Tβ4)能够促进毛发生长.旨在构建CAG启动子指导的全身性过表达Tβ4小鼠(CTP小鼠)和角蛋白14(Keratin14,Krt14)启动子指导的表皮特异性过表达Tβ4小鼠(KTP小鼠),比较两种转基因小鼠模型的Tβ4表达情况,为进一步研究Tβ4对毛发生长的影响以及其作用机制奠定基础.首先构建CAG启动子指导的全身性过表达载体pODsRed-CTP,然后用pODsRed-CTP和Krt14启动子指导的pODsRed-KTP表达载体,通过原核注射技术制作转Tβ4基因小鼠.PCR鉴定得到CTP小鼠2只,阳性率1.6%;KTP小鼠4只,阳性率8%.通过Real-time PCR检测Tβ4基因mRNA水平表达量,结果显示Tβ4在CTP小鼠皮肤中mRNA水平表达量是对照小鼠的1.24和1.13倍,在KTP小鼠皮肤中mRNA水平表达量分别是对照小鼠的4.22、1.84、4.60和2.74倍.Western blotting检测Tβ4在蛋白水平的表达,发现CTP小鼠皮肤中Tβ4蛋白的表达量没有显著变化,而KTP小鼠皮肤中Tβ4蛋白表达水平显著升高.与CTP小鼠相比,KTP小鼠更适合作为Tβ4过表达小鼠模型,深入研究Tβ4对毛发的影响以及作用机制.

伴有色素沉着的单纯型大疱性表皮松解症K5和K14基因突变分析

目的检测宁夏地区一伴有色素沉着的单纯型大疱性表皮松解症家系的角蛋白5（keratin5，K5）和角蛋白14（keratin14，K14）基因突变。方法提取患者及对照组的外周血DNA，采用聚合酶链反应对K5和K14基因的全部外显子进行扩增，并进行DNA测序。结果在测序的11例患者中，发现K5的1个错义突变（237C〉T），而在家系正常人及100名正常对照中均未发现该突变。结论K5基因的错义突变可能与该家系患者的发病有关。

细胞角蛋白14与肿瘤

细胞角蛋白14（CK14）除在正常基底细胞表达外，在非小细胞肺癌（NSCLC）、乳腺癌、宫颈癌、食管癌等多种肿瘤中都有不同程度的表达。CK14主要表达于肿瘤中心的周边部位，在肿瘤的非侵袭性部分十分罕见，并且肿瘤的侵袭性越强，含有 CK14的细胞就越多。由此看来，CK14基因在多种肿瘤的发展及转移中起到非常重要的作用，可作为肿瘤诊断、治疗和预后评估的一项指标。

应用Cre-loxP系统构建表皮细胞中p75神经营养因子受体基因条件性敲除小鼠模型及其鉴定

目的应用Cre-loxP系统构建表皮细胞中p75神经营养因子受体(p75NTR )基因条件性敲除的小鼠模型并进行鉴定。方法应用Cre-loxP系统将5只6~8周龄雌雄不限(用于繁殖的小鼠鼠龄和性别下同)p75NTRflox/flox转基因C57BL/6J小鼠和5只角蛋白14启动子驱动(KRT14-)Cre+/-转基因C57BL/6J小鼠进行饲养和杂交。从繁育产生的第1代小鼠中筛选出5只p75NTRflox/+·KRT14-Cre+/-小鼠与5只p75NTRflox/flox小鼠进行交配,获得第2代小鼠。第2代小鼠出生20~25d,切取每只小鼠鼠尾,通过PCR法进行基因型鉴定。分别选取经鉴定后生长至6周龄的p75NTR基因完全条件性敲除小鼠、野生型小鼠各4只处死,切取腹部皮肤组织和脑组织,经免疫组织化学染色对比观察p75NTR在2种小鼠2种组织中的表达情况;另切取腹部皮肤组织,经苏木精-伊红染色观察2种小鼠组织形态学变化。结果(1)共繁育第2代小鼠20只,其中4只小鼠基因型为p75NTRflox/flox·KRT14-Cre+/-(p75NTR-/-),即p75NTR基因完全条件性敲除小鼠;5只小鼠基因型为p75NTRflox/+·KRT14-Cre+/-,即p75NTR基因部分条件性敲除小鼠;5只小鼠基因型为p75NTRflox/flox·KRT14-Cre-/-,6只小鼠基因型为p75NTRflox/+·KRT14-Cre-/-,均为野生型小鼠。(2)p75NTR基因完全条件性敲除小鼠皮肤表皮组织中未见p75NTR表达,野生型小鼠皮肤表皮组织中可见较多p75NTR阳性表达;p75NTR基因完全条件性敲除小鼠和野生型小鼠脑组织中均有丰富p75NTR阳性表达。(3)p75NTR基因完全条件性敲除小鼠和野生型小鼠皮肤表皮组织均无生长异常情况且毛囊结构均完整。结论应用Cre-loxP系统能够成功构建表皮细胞中p75NTR基因条件性敲除小鼠模型且小鼠皮肤组织形态无明显变化。

城市大气细颗粒物PM2.5对人角质形成细胞屏障相关蛋白表达的影响

目的明确大气颗粒物PM2.5对人角质形成细胞中皮肤屏障相关蛋白和前炎症细胞因子表达的影响。方法取5例包皮环切术后的包皮分离培养人原代角质形成细胞。0(对照组)、10、50、100、200mg/LPM2.5分别刺激人原代角质形成细胞24h,CCK-8检测细胞存活率。50mg/LPM2.5处理原代角质形成细胞0、3、6、9、12、18和24h,以只加培养基的孔作为对照组,CCK-8检测细胞存活率。荧光定量PCR、Western印迹法分别检测不同浓度PM2.5刺激角质形成细胞24h后细胞内丝聚蛋白、角蛋白14和紧密连接蛋白1mRNA及蛋白表达,ELISA法检测各组角质形成细胞培养上清液中白细胞介素1α(IL-1α)、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、IL-33水平。采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析、LSD-t检验及Pearson相关性分析。结果不同浓度PM2.5处理24h后,10mg/LPM2.5组角质形成细胞存活率与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),而50、100、200mg/LPM2.5组细胞存活率均显著低于对照组(均P<0.05)。50mg/LPM2.5处理角质形成细胞不同时间,随PM2.5作用时间的延长,细胞生存率逐渐降低后稳定在一定水平,24h细胞生存率为72.37%±3.12%。不同浓度PM2.5刺激角质形成细胞24h后,10、50mg/LPM2.5组丝聚蛋白mRNA相对表达量(1.27±0.15、1.32±0.09)和角蛋白14mRNA相对表达量(1.15±0.13、1.08±0.16)均高于对照组(均P<0.05);100、200mg/LPM2.5组丝聚蛋白mRNA相对表达量(0.84±0.11、0.42±0.12)和角蛋白14mRNA相对表达量(0.67±0.09、0.74±0.11)均低于对照组(均P<0.05);而10、50、100、200mg/LPM2.5组紧密连接蛋白1mRNA表达均显著低于对照组(均P<0.05)。Western印迹显示,50、100mg/LPM2.5组丝聚蛋白表达高于对照组(均P<0.05),而10、200mg/LPM2.5组与对照组差异无统计学意义(均P>0.05)。各PM2.5组角蛋白14的表达均高于对照组(均P<0.05)。10mg/LPM2.5组紧密连接蛋白1表达与对照组相比差异无统计学意义(P=0.87),50、100、200mg/LPM2.5组均显著高于对照组(均P<0.05)。不同浓度PM2.5刺激角质形成细胞均引起TSLP、IL-1α、IL-33表达升高(均P<0.01)。Pearson相关分析显示,角质形成细胞前炎症因子TSLP、IL-1α、IL-33的分泌量与PM2.5浓度呈正相关(r=0.57、0.67、0.91,均P<0.05)。结论暴露于PM2.5处理可致角质形成细胞生存率下降,丝聚蛋白、角蛋白14和紧密连接蛋白1表达发生异常改变,同时伴有前炎症细胞因子IL-1α、TSLP、IL-33表达升高,可能导致皮肤屏障功能受损。

鳕鱼多肽对大鼠皮肤损伤修复的作用及相关机制

目的探讨鳕鱼多肽对大鼠皮肤损伤的修复作用及相关机制。方法24只SD大鼠,每只大鼠背部近脊柱皮肤造6 mm直径损伤模型。同一只大鼠背部分为空白对照(生理盐水组)、阳性对照(重组人表皮生长因子组)、实验组(鳕鱼多肽组)。术后用数码显微镜观察创面,用硫酸坐标纸记录创面大小。于术后第3、6、9、12天分别急性处死6只大鼠,行HE染色,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测。结果第6、12天,鳕鱼多肽组创面明显缩小,与生理盐水组比较,差异有统计学意义(P<0.05);与生理盐水组比较,鳕鱼多肽组第3天表皮细胞生长因子(EGF)、角蛋白14(K14)表达高,第6、12天EGF、K10、K14表达均较高,差异有统计学意义(P<0.05 )。结论鳕鱼多肽促进SD大鼠全层皮肤损伤的修复,可能机制为促进角质形成细胞增生,上调K10、K14、EGF基因表达。