限制性内切酶的无细胞快速制备研究

限制性内切酶在分子生物学研究中是一类重要的工具酶,目前主要由异源生物合成的方式进行表达与生产,由于它们对特定的DNA序列(即酶切位点)具有切割活性,在异源表达时会对宿主产生较高的细胞毒性。而无细胞生物合成体系具有操作快捷、灵活高效、无细胞毒性等优势,因此,本研究利用无细胞蛋白合成(cellfree protein synthesis,CFPS)技术进行限制性内切酶的表达制备。本课题组选择3种限制性内切酶Eco RⅠ、BamHⅠ和BsaⅠ作为研究对象,构建线性DNA为表达模板,无需甲基化酶对宿主的保护,在6 h内即可完成蛋白表达。经亲和色谱与凝胶色谱两步纯化,得到了纯度高(95%左右)、酶活相当(EcoRⅠ3.7×10^(5)~3.7×10^(6)U/mg,BamHⅠ8.3×10^(2)~4.1×10^(3)U/mg,BsaⅠ4.4×10^(5)~4.4×10^(6)U/mg)的目标蛋白。同时,建立了限制性内切酶的实时酶活检测方法,将有助于限制性内切酶的催化和快速筛选研究。本研究所开发的限制性内切酶无细胞表达制备体系,从基因模板构建到纯化蛋白所需时间短(1~2 d)、蛋白产量高(32.5~130 mg/L无细胞反应)、制备效率高(1.3×10^(5)~5.7×10^(8)U/L无细胞反应),具有较好的普适性,为限制性内切酶的研发与制备生产提供了新的思路。

不同降水年型休闲期耕作蓄水与旱地小麦籽粒蛋白质形成的关系

【目的】中国旱地小麦常年降水量少且分配不均,如何蓄水保墒尤其是蓄积休闲期降水提高生育期土层水分含量,以供作物生长发育需要成为当前研究的热点。论文旨在探讨不同降水年型,休闲期耕作方式对土壤水分贮备水平、小麦籽粒产量和品质指标的影响,进而为有效利用一年一作旱地小麦休闲期降水,提高小麦籽粒产量,优化籽粒品质提供理论依据。【方法】于2009—2012年连续3年在山西闻喜县开展大田试验,以运旱20410为供试品种,设置休闲期深翻(深度25—30 cm,DT)、休闲期深松(深度30—40 cm,SS)、对照(休闲期不进行任何耕作处理,CK)3个水平,随机区组设计,研究休闲期深翻、深松对旱地冬小麦0—300 cm土层水分含量、籽粒蛋白质形成的影响。【结果】休闲期耕作较对照提高播种前0—300 cm土层蓄水量,枯水年提高63—91 mm,平水年提高41—70 mm,丰水年提高54—74 mm;休闲期耕作较对照显著提高小麦籽粒产量,枯水年提高981—1 330kg·hm-2,平水年提高883—1 089 kg·hm-2,丰水年提高1 256—1 457 kg·hm-2。且枯水年、平水年深翻效果较好,而丰水年深松效果较好。休闲期耕作较对照显著提高平水年、丰水年小麦花后旗叶谷氨酰合成酶(GS)活性、花后5—15 d旗叶谷氨酸合成酶(GOGAT)活性,显著提高不同降水年型籽粒GS、GOGAT活性。休闲期耕作较对照提高平水年、丰水年籽粒清蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白含量、蛋白质含量,提高枯水年、丰水年谷醇比,提高不同降水年型籽粒蛋白质产量。休闲期深翻处理枯水年籽粒蛋白质产量,平水年籽粒清蛋白、醇溶蛋白、蛋白质含量及蛋白质产量显著高于深松处理;休闲期深松处理丰水年籽粒蛋白质及其组分含量、蛋白质产量、谷醇比显著高于深翻处理。不同降水年型休闲期耕作条件下,开花期土壤水分影响了旗叶GS、GOGAT活性,尤其是旗叶GS活性,旗叶GS活性与籽粒蛋白质及其组分含量、谷醇比、蛋白质产量关系密切,开花期土壤水分与籽粒球蛋白、醇溶蛋白、蛋白质含量、籽粒蛋白质产量关系密切,尤其是谷醇比与开花期深层土壤水分的关系较密切。【结论】旱地小麦休闲期耕作有利于蓄积休闲期降水,提升旱地小麦土壤水分贮备水平,如播种前土壤蓄水量和开花期土壤蓄水量,从而提高产量、优化品质,其中枯水年、平水年以休闲期深翻效果较好,丰水年以休闲期深松效果较好。

小麦不同近缘种籽粒蛋白质积累及其关键酶活性的研究

为明确小麦不同近缘种籽粒蛋白质积累的演进规律,以二倍体野生一粒小麦(T.boeoticum)、栽培一粒小麦(T.monococcum)、节节麦(Ae.tauschii)和黑麦(S.cereale),四倍体野生二粒小麦(T.dicoccoides)、栽培二粒小麦(T.dicoccum)和硬粒小麦(T.durum),六倍体普通小麦(T.aestivum)扬麦9号、豫麦34和扬麦158为材料,采用盆栽试验研究了小麦不同近缘种籽粒蛋白质积累的动态变化及相关酶活性的差异。结果表明,与六倍体普通小麦相比,二倍体和四倍体材料籽粒产量和蛋白质产量低,但蛋白质含量高,其灌浆初期氮代谢能力比较强,硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)活性较高,蛋白质积累速度快;除黑麦外,其他二倍体和四倍体材料蛋白质合成关键酶活性下降早而快,在灌浆中后期低于普通小麦,蛋白质积累的功能期较短。因此,普通小麦灌浆后期较高的氮代谢酶活性和较长的持续期是提高籽粒产量和蛋白质合成的重要生理原因。

铝诱导豇豆根系有机酸分泌特性的研究

以耐铝豇豆品种‘T6’和铝敏感豇豆品种‘S3’为试材,分析铝诱导根系有机酸的分泌特性,并以耐性品种‘T6’为试材,研究铝诱导的根系有机酸分泌与有机酸代谢的关系。结果表明:铝诱导豇豆根系分泌柠檬酸和苹果酸。苹果酸的分泌量随着铝处理浓度的增加而升高,耐铝品种苹果酸的分泌量高于铝敏感品种,‘T6’和‘S3’在50μmol·L-1铝处理时根系苹果酸分泌量分别是5μmol·L-1铝处理时的17.8和3.5倍。不同铝处理时间下2个豇豆品种根系有机酸的分泌均存在一个6 h的滞后期,属于分泌模式Ⅱ。随着铝处理浓度的增加,‘T6’根系苹果酸的分泌量显著增加,同时根尖苹果酸含量显著减少,与苹果酸代谢相关的酶活性没有显著变化;阴离子通道抑制剂蒽-9羧酸和蛋白合成抑制剂环已米特可以完全抑制铝诱导的豇豆根系有机酸分泌,根尖有机酸含量没有显著变化。推测:根系分泌苹果酸是豇豆抵御铝毒害的机制之一,苹果酸的分泌与苹果酸代谢无关,而阴离子通道可能介导此分泌过程。