CCK-8对KLH免疫小鼠脾细胞Th1／Th2平衡的影响

目的:探讨八肽胆囊收缩素(CCK-8)对Th1/Th2平衡的调节作用。方法:给予BALB/c小鼠钥孔戚血蓝蛋白(KLH)免疫同时体内给予不同剂量的CCK-8,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其脾细胞培养上清中Th1型细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)和Th2型细胞因子白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)水平,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测脾细胞中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5 mRNA表达;ELISA法检测血清中Th1型抗KLH抗体IgG2a和Th2型抗KLH抗体IgG1水平。结果:①KLH免疫使小鼠脾细胞分泌Th1/Th2型细胞因子水平明显增高,mRNA表达增高,KLH免疫同时给予CCK-8可使脾细胞培养上清中IFN-γ、IL-2含量进一步增加和IFN-γ、IL-2 mRNA表达增高,而使IL-4、IL-5含量降低,IL-4、IL-5 mRNA表达减低和降低IL-4/IFN-γ比值。②KLH免疫小鼠血清中IgG2a、IgG1发生不同程度增高,CCK-8可使其血清中IgG1水平减低而使IgG2a水平增高。结论:CCK-8可促进KLH免疫小鼠体内Th1反应,使Th2优势反应向Th1方向转变。

KLH单独刺激不影响黑线仓鼠的静止代谢率

根据生活史理论,免疫功能与产热和繁殖等其他生理学功能类似,具有能量代价。然而,关于提高免疫能力的能量学代价的实验例证很少,且此类代价可能受所选择的免疫学参数和实验测定的影响。为探究提高小型哺乳动物免疫能力的能量学代价,以匙孔血蓝蛋白(Keyhole limpet haemocyanin,KLH)作为外源抗原刺激,在注射前(第0天)、注射后第5天和第10天,分别测定非繁殖期雌、雄性黑线仓鼠体重和静止代谢率(Resting metabolic rate,RMR)的变化,通过眼眶静脉丛采血技术和ELISA分析,分别测定第5天(抗Ig M抗体)和第10天(抗Ig G抗体)动物血清抗体含量的变化。结果显示:(1)雄鼠的体重高于雌鼠,雌、雄鼠实验组和对照组之间的体重均无差异且不随时间而增加;(2)无论雌鼠还是雄鼠,注射KLH组血清中抗Ig M和抗Ig G抗体的含量均高于注射生理盐水的对照组;(3)注射KLH前后,RMR既无性别差异,也无组间差异,同一组动物的RMR均不随取样时间点而变化(KLH注射后第5天和第10天)。结果表明,单一的KLH刺激激活了黑线仓鼠的体液免疫,但在能量不受限的情况下不影响体重和能量收支的变化。有两种可能的解释:黑线仓鼠增强的体液免疫可能以免疫系统内另一免疫组分活动的降低作为代价,或它对体液免疫应答具有构建能力,温和的免疫刺激不伴随额外的能量学代价。

抗原钥孔戚血蓝蛋白(KLH)对金鱼(Carassius auratus)体液免疫的影响研究

以钥孔戚血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)为抗原、Montanide ISA 763 A为佐剂开展金鱼免疫试验,检测血清抗体水平,评估金鱼体液免疫应答情况,以期为其免疫策略的制定提供依据。试验在水温15~18℃时进行,采用(20±3)g体重的健康鱼150尾,随机均分为三组,第一组使用(KLH+Montanide ISA 763 A)免疫,第二组仅使用KLH免疫,第三组注射等量的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered solution,PBS)为对照,历经三次免疫并对4次采样的血清样本进行ELISA检测。结果显示,第一组和第二组均检测到较高的抗KLH抗体水平,在第二次、第三次免疫后,添加ISA佐剂的第一组抗体仍维持较高水平,而在仅用KLH免疫的第二组抗体水平下降,并降低到对照组水平,表明使用(KLH+Montanide ISA 763 A)免疫金鱼可以获得更加持久和稳定的免疫效果,而仅注射KLH的免疫效果较为短暂。研究还说明金鱼在低温情况下,可以产生良好的体液免疫应答。

小鼠抗KLH多克隆抗体的制备及TDAR实验间接ELISA定量检测方法的建立

目的:通过制备小鼠抗KLH多克隆抗体,优化反应条件建立KLH特异性抗体ELISA定量分析方法,以期提供一种特异性好、灵敏度高及误差低的TDAR实验检测方法。方法:利用盐析沉淀和亲和层析纯化技术分离和纯化小鼠抗KLH特异性多克隆IgG抗体;以纯化后的抗体作为标准品,建立TDAR实验间接ELISA定量检测方法,并对该方法进行线性范围、特异性、变异系数(CV)及检测限验证。结果:以KLH包被浓度为80μg/ml,山羊抗小鼠IgG/HRP酶标二抗的稀释倍率为1∶20000条件进行间接ELISA定量分析的方法学验证,检测线性范围为390.63~25000 ng/ml,R^(2)=0.9848,线性良好;批内和批间CV均<10%;检测限为194.83 ng/ml。结论:通过制备抗KLH多克隆抗体,并优化实验反应条件来建立间接ELISA定量分析方法,其线性范围、特异性及批内、批间CV均满足实验要求,是一种高灵敏度的TDAR实验检测方法。

光谱法研究硝苯柳胺与钥孔戚血蓝蛋白的相互作用

采用荧光光谱和紫外吸收光谱研究了不同温度下硝苯柳胺与钥孔戚血蓝蛋白(KLH)的相互作用。结果发现,KLH的特征荧光峰猝灭,硝苯柳胺对KLH的荧光猝灭机制属于静态猝灭;由Lineweaver-Burk方程计算出不同温度下硝苯柳胺与KLH之间的结合常数K分别为3.81×104L/mol(25℃)和3.01×104L/mol(37℃);由Van′tHoff方程计算出ΔH和ΔS平均值分别为-15.09kJ/mol和37.055Jmol-1K-1,二者之间的作用力主要为静电作用力;该过程是一个熵增加、Gibbs自由能降低的自发分子间作用过程;根据Frster非辐射能量转移机制求得给体与受体间的结合距离r为4.61nm,能量转移效率为0.0403。同步荧光光谱表明,硝苯柳胺能够被血蓝蛋白存储和转运,但结合时对蛋白构象有一定影响。

氯硝柳胺及其衍生物与钥孔戚血蓝蛋白的相互作用

以氯硝柳胺为原料合成了聚乙二醇200基氯硝柳胺.采用荧光光谱、同步荧光光谱、紫外吸收光谱和圆二色谱研究了氯硝柳胺及其衍生物与钥孔戚血蓝蛋白(KLH)的相互作用.结果表明,两种药物分子对KLH的荧光猝灭机制属于静态猝灭;由Lineweaver-Burk方程计算出不同温度下结合常数K,但是聚乙二醇200基氯硝柳胺与KLH的作用相对较弱;由Van′t Hoff方程计算出ΔH和ΔS平均值,结合力主要为静电作用力;热力学函数计算结果表明,氯硝柳胺及其衍生物与KLH的作用过程是一个熵增加、Gibbs自由能降低的自发分子间作用过程;根据Frster非辐射能量转移机制求得给体与受体间的结合距离r均小于7nm;同步荧光光谱表明,氯硝柳胺及其衍生物能够被血蓝蛋白存储和转运,但结合时对蛋白构象有一定影响;圆二色谱测得加入两种药物后,KLH的α-螺旋含量均降低,二级结构发生改变.通过比较氯硝柳胺及其衍生物与KLH的相互作用,初步探讨了分子结构与其结合能力之间的联系.

应用T细胞依赖性抗体反应模型评价参麦注射液对大鼠免疫功能的影响

目的建立T细胞依赖性抗体反应(TDAR)大鼠模型,研究参麦注射液(SMIJ)对大鼠免疫功能的影响。方法 SD大鼠按分组分别ig给予环孢素A(CSA)0.02 g·kg-1,iv给予SMIJ溶剂或SMIJ 0.6,1.2和2.4 g·kg-1,每天1次,连续28 d。于给药第15天和第22天经左后足趾sc给予钥孔其虫戚血蓝蛋白(KLH)2.4 mg·kg-1进行免疫刺激。实验期间观察大鼠的一般状态,每周测体质量和摄食量。在第20天和第29天用ELISA法分别测定大鼠血清KLH-Ig M和KLH-Ig G抗体浓度,第29天活杀大鼠,应用全自动血液分析仪测定血液红细胞和白细胞数及白细胞分类,用天平称取肺、肝、脾和胸腺质量并计算脏器系数,采用HE染色法观察肺、肝、脾、胸腺和淋巴结组织病理变化。结果实验期间未见大鼠死亡,各给药组体质量增长和摄食量无异常。与正常对照组相比,模型组大鼠血清KLH-Ig M和KLH-Ig G抗体浓度均明显增高(P<0.01),提示KLH引起机体免疫应答;与模型组相比,血清KLH-Ig M和KLH-Ig G抗体浓度在CSA组均明显降低(P<0.01),而在SMIJ溶剂组和给药组则无明显变化。给药后第29天,与正常对照组相比,模型组大鼠各项血液学指标和脏器系数无差异,各组织脏器亦无明显病变;与模型组相比,CSA组白细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数、脾和胸腺脏器系数均明显降低(P<0.05,P<0.01),脾出现白髓范围和脾小体淋巴细胞数目减少及淋巴小结界限不清等免疫抑制现象,而SMIJ溶剂和给药组各项血液学和脏器系数均无明显改变,各组织脏器亦无明显病变。结论建立了SD大鼠TDAR研究模型,连续尾静脉给予SMIJ 28 d对SD大鼠TDAR无明显影响。

TDAR在药物临床前毒理学研究中的应用

目的 TDAR试验被认为是检测药物潜在免疫毒性预测性较好的功能性试验,本文综述总结TDAR检测方法在药物临床前毒理学研究中应用的一般原则,以便同行参考。方法通过综合分析、对比,总结国内外文献资料中关于TDAR的实验方法和评价,得出在药物临床前毒理学研究中应用的一般原则。结果 T细胞依赖性抗体反应(TDAR)是检测免疫功能的主要试验。TDAR通过人为引入外来抗原,反映药物或化学物质对免疫系统整体的影响,目前在药物免疫毒理学研究中逐渐得到广泛应用。结论 TDAR试验是检测药物潜在免疫毒性预测性较好的功能性试验,该试验可以用来在临床前的反复给药毒性试验或者临床试验中检测免疫功能的改变,可以对候选药物的免疫调节和免疫毒性特点进行早期预测。

免疫性内耳病模型的建立及其内耳干扰素-γ的表达

目的:建立免疫性内耳病(IMIED)模型,并检测内耳干扰素-γ(IFN-γ)表达的变化情况。方法:将20只豚鼠按配对设计方法分为实验组和对照组。实验组采用钥孔戚血蓝蛋白(KLH)在已致敏的豚鼠圆窗龛局部免疫,对照组用PBS代替KLH免疫豚鼠;观察血清中特异性KLH抗体水平、听觉功能及内耳病理形态变化,并行酶免疫组化试验观察内耳IFN-γ的表达。结果:实验组免疫前后ABRⅢ波阈值的均值差异有统计学意义(P<0.05),免疫后实验组有7只动物(12耳)出现听损,且血清中特异性KLH抗体水平较免疫前明显升高(P<0.05);对照组免疫前后ABRⅢ波阈值的均值和血清KLH抗体水平的差异均无统计学意义(P>0.05);免疫后实验组ABRⅢ波阈值的均值和血清KLH抗体水平均高于对照组(P<0.05)。实验组免疫后内耳组织中有炎症细胞浸润,部分豚鼠内耳有迷路积水。对照组豚鼠内耳组织中无明显IFN-γ表达,实验组IFN-γ表达主要分布在血管纹、螺旋韧带、螺旋神经节、Corti器及蜗轴小血管周围。结论:在已致敏的豚鼠圆窗龛局部免疫,诱导并造成IMIED模型的成功率较高。正常豚鼠内耳中几乎没有IFN-γ表达,而在IMIED豚鼠内耳中IFN-γ有显著表达,提示IMIED发生发展可能与IFN-γ表达有关。

聚乙二醇200基硝苯柳胺与钥孔戚血蓝蛋白的相互作用

采用荧光光谱、紫外吸收光谱和圆二色谱(CD)研究了聚乙二醇200基硝苯柳胺与钥孔戚血蓝蛋白(KLH)的相互作用。结果表明,聚乙二醇200基硝苯柳胺对KLH的荧光猝灭机制属于静态猝灭;由Lineweaver-Burk方程计算出不同温度下结合常数K,由Van’t Hoff方程计算出△H和△S平均值,结合力主要为静电作用力;根据F rster非辐射能量转移机制求得给体与受体间的结合距离r=5.76 nm;同步荧光光谱表明,聚乙二醇200基硝苯柳胺能够被KLH存储和转运,但结合时对蛋白的构象有一定的影响;圆二色光谱的数据表明相互作用后KLH的二级结构发生了改变:KLH的α-螺旋的含量从43.1%下降到37.8%。

免疫性内耳病模型的建立及地塞米松圆窗和全身给药的疗效

目的建立免疫性内耳病模型,并初步比较地塞米松圆窗局部给药和全身给药治疗的效果。方法先用钥孔嘁血蓝蛋白(KLH)加完全弗氏佐剂在豚鼠背部多点皮内注射,2周后用KLH加不完全弗氏佐剂加强,同日通过手术将浸满KLH的小块明胶海绵置于圆窗上制作免疫诱导的内耳病模型。在此基础上使用微渗透泵(同时设PBS对照组)圆窗给药,以腹腔注射全身给药治疗免疫性内耳病,给药前后听性脑干反应(ABR)测试比较治疗效果。结果①动物模型ABR听阈:6只对照组豚鼠无明显听力损失,39只实验组豚鼠听力损失在10 dB以上的有22只;②治疗效果比较:17只听力损失≥15 dB的豚鼠模型随机分为三组:圆窗局部给药6只动物,治疗全部有效,ABR听阈平均下降13.3 dB;全身给药6只动物,4只有效,ABR听阈平均下降13.7 dB;PBS组全部无效。结论KLH经圆窗诱导的免疫性内耳病模型的成功率较高;地塞米松跨圆窗给药的有效性不亚于全身给药。

血蓝蛋白不同免疫途径对小鼠T细胞依赖性抗体反应的影响

目的探讨以血蓝蛋白(KLH)为特异性T细胞依赖性抗原,不同免疫途径下对小鼠T细胞依赖性抗体反应(TDAR)的影响。方法选用SPF级KM小鼠,分为静脉注射组、皮下注射组、腹腔注射组及空白对照组。通过上述三种途径免疫小鼠,免疫剂量为每只200μg,第10天等剂量加强免疫一次,空白对照组不给予任何药物。于末次免疫后第7天,采血检测血清KLH抗体Ig G含量,计算脾脏器系数,HE染色观察脾组织学变化。结果 KLH三种不同免疫途径均可引起脾出现不同程度次级淋巴滤泡及生发中心的形成,B淋巴细胞凋亡,边缘区细胞增多等病理改变,以腹腔和静脉免疫途径脾形态变化更为明显;三种不同免疫途径均可引起机体产生抗体,与正常对照组相比差异具有显著性(P<0.05),其中静脉途径引起抗体产生浓度最高,明显高于其他两种免疫途径(P<0.05);各组脾脏器系数存在部分差异,其中静脉注射组和腹腔注射组脾脏器系数显著高于空白对照组(P<0.05),静脉注射组脾脏器系数显著高于皮下注射组和腹腔注射组(P<0.05)。结论 KLH三种不同免疫途径引起机体产生抗体浓度、脾脏器系数及形态改变是不完全相同的,可通过这些差异多方面分析TDAR实验结果。

T细胞依赖性抗体反应检测方法研究进展

T细胞依赖性抗体反应(TDAR)是检测免疫功能的主要试验技术。根据使用抗原及抗原特异性抗体检测方法的不同,TDAR方法包括绵羊红细胞(SRBC)作为抗原的空斑形成细胞(PFC)方法、SRBC作为抗原的ELISA方法和钥孔戚血蓝素(KLH)作为抗原的ELISA方法。KLH作为抗原比SRBC稳定、易标准化且容易获得,ELISA检测方法操作简便、样本可保存,便于整合到临床前毒理学研究中。本文综述了TDAR检测方法对免疫毒性的预测作用及其研究进展。

白细胞介素-13结合小肽的筛选及其对气道上皮细胞分泌黏蛋白5AC的影响

目的筛选与白细胞介素-13(interleukin-13,IL-13)具有较强结合能力的功能小肽,并检测其对气道上皮细胞HBE16分泌黏蛋白(mucin,MUC)5AC的影响。方法以重组人IL-13为靶蛋白,采用固相包被法对噬菌体随机展示十二肽库进行亲和筛选,并进行测序;将获得的与IL-13具有高亲和力的小肽偶联到嗜孔蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin,KLH)载体上,制备KLH偶联肽K1、K3、K4,通过夹心ELISA法检测3种偶联肽对IL-13的封闭作用;通过细胞试验检测3种偶联肽对HBE16细胞分泌MUC5AC的影响。结果经6轮亲和富集筛选,获得了3个与IL-13具有较高亲和力的噬菌体克隆,插入的十二肽编号依次为P1、P3、P4;3种偶联肽K1、K3、K4对IL-13均具有明显的封闭作用;经K1+IL-13、K3+IL-13和K4+IL-13处理的HBE16细胞中MUC5AC基因mRNA的转录水平和蛋白表达水平均明显低于IL-13对照组(P<0.01)。结论经偶联肽封闭后,可减少IL-13刺激的气道上皮细胞HBE16中MUC5AC的分泌,为慢性气道炎症黏液高分泌的防治提供了新的思路和手段。

TGF-β1多肽疫苗抗肝纤维化的鉴定

目的鉴定转化生长因子β1(TGF-β1)的优势抗原表位偶联钥孔戚血蓝素(KLH)蛋白人工合成多肽疫苗对SD大鼠的免疫原性,并探讨对SD大鼠实验性肝纤维化的抑制效应。方法人工合成TGF-β1优势抗原表位多肽偶联KLH蛋白后,作为多肽疫苗免疫SD大鼠。40只SPF级SD大鼠随机分为4组,即正常对照组、佐剂对照组、造模组(CCl4诱导)、多肽疫苗组,每组各10只,采用CCl4复合因素诱发大鼠肝纤维化模型。多肽疫苗组动物第1、14、28天连续三次每次腹股沟处及腋窝处多点注射50μg0.5ml乳剂(相同体积的弗氏佐剂加合成肽),此后每隔7d免疫一次无任何佐剂的合成肽(50μg0.5ml水剂),共免疫10周;造模组及多肽疫苗组自第3周起首次皮下注射40%CCl4橄榄油溶液2ml/kg,以后每周2次背部皮下注射40%CCl4橄榄油溶液1.5ml/kg、30%乙醇6ml/kg隔日灌胃并给予高脂饮食连续造模8周。正常对照组大鼠同时给予相同剂量的橄榄油溶液皮下注射;佐剂对照组大鼠同期给予注射用水加弗氏佐剂0.5ml乳剂。第10周处死所有大鼠,ELISA检测血清TGF-β1抗体、肝纤维化指标(HA、Ⅳ-C),全自动生化仪检测血清ALT、AST、TBIL、ALB和GLB,碱水解法检测肝脏羟脯氨酸(Hyp)含量,并进行肝脏病理检查。结果 TGF-β1多肽疫苗可以诱导SD大鼠产生一定量的抗TGF-β1抗体,但是与对照组比较没有统计学差异(P>0.05)。多肽疫苗组生化指标ALT、AST、TBIL与造模组比较有统计学差异(P<0.05),但是血清HA、Ⅳ-C含量及肝脏Hyp含量与造模组相比并没有统计学差异(P>0.05)。HE、VG染色可见多肽疫苗组较造模组肝组织病理变化及纤维化程度无明显差异。结论 TGF-β1多肽疫苗可以诱导SD大鼠产生一定量的抗TGF-β1中和抗体,且可能具有保肝作用,但其干预治疗实验性大鼠肝纤维化的疗效较差,有待进一步研究。

小鼠源性ABIN1蛋白的抗体制备及功能验证

目的制备小鼠源性A20结合核因子κB活化抑制蛋白1(A20 binding inhibitor of NF-κB activation 1,mABIN1)的多克隆抗体并进行功能验证,利用该抗血清对大鼠脑区ABIN1的分布进行验证。方法利用mABIN1片段与钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)耦联得到的肽段为免疫原,免疫新西兰大耳白兔3次,共35 d,获得抗血清,分别用ELISA、蛋白免疫(Western)印迹和免疫组织荧光化学法对抗体的特异性进行验证;使用上述验证所得的特异性抗血清,通过Western印迹检测ABIN1在大鼠各脑区的分布;对所得到的特异性抗血清进行纯化。Western印迹证明,纯化后的抗体杂带较纯化前明显降低,但效价也有所下降。结果与结论成功制备了兔抗小鼠ABIN1抗血清并对抗血清进行纯化,经该抗血清首次验证ABIN1在大鼠嗅球、皮质、海马、纹状体、伏隔核、丘脑、下丘脑、小脑、脑干及脊髓等中枢神经系统不同部位均有广泛分布,为在动物体内进行ABIN1生物学功能研究提供了有利工具。

记忆系统免疫毒性评价模型的建立

基于T细胞依赖性抗体实验思路，建立具有剂量关系的记忆系统免疫毒性评价模型。雌性SD大鼠分别在d1和d22尾静脉注射抗原钥孔戚血蓝素（KLH）300μg／kg，d22～d24灌胃给予环磷酰胺（1，5或20mg·kg-1d-1，连续3d）。结果表明，d27时1高剂量组大鼠外周血中白细胞、淋巴细胞和中性粒细胞数目比阴性组显著降低，而d30和d33时中性粒细胞数目增加。免疫酶联技术检测结果表明，1高剂量组大鼠特异性抗体（IgG）含量显著降低（P〈0．01），且具有时间、剂量依赖性。