肝癌相关抗原kinectin基因片断的重组表达

目的:研究肝癌相关抗原kinectin基因片断的体外重组表达方法,为该抗原的生产奠定基础。方法:用PCR法扩增肝癌相关抗原kinectin的基因片断,将目的基因插入表达载体pMAL-C2上麦芽糖结合蛋白(MBP)基因下游的多克隆位点,转化DH5α菌。通过蓝白斑筛选、PCR鉴定、内切酶鉴定及DNA测序筛出正确的重组子,并用其转化TB1菌。用IPTG对重组的TB1工程菌进行诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定。结果:kinectin基因片断正确插入pMAL-C2载体的多克隆位点,用IPTG对工程菌进行诱导,可见目的蛋白条带出现。结论:pMAL-C2载体可用于对肝癌相关抗原kinectin的体外基因重组表达。

肝癌相关抗原Kinectin的多克隆抗体制备、鉴定及初步应用

目的制备本课题组报告的肝癌相关抗原Kinectin的多克隆抗体,并鉴定其免疫学特性。方法以本课题组前期构建的人MBP-Kinectin融合片段重组质粒为基础,原核表达和亲和层析大量纯化MBP-Kinectin融合蛋白,并免疫新西兰兔制备多克隆抗体;用间接ELISA法测定抗体效价,用Western blot鉴定抗体的特异性。同时用Kinectin多克隆抗体检测Kinectin在正常成人肝细胞HL-7702和人肝癌细胞株SMMC-7721内的表达。结果通过免疫新西兰兔获得抗Kinectin抗体,ELISA测定纯化的Kinectin抗体效价最高为1∶12 800,Western blot结果显示Kinectin抗体具有较好的特异性。免疫细胞化学和western blot检测发现Kinectin蛋白在肝癌细胞株内的表达显著高于正常成人肝细胞株。结论制备的抗Kinectin抗体具有较高的效价和特异性,能满足Western blot和免疫细胞化学检测Kinectin蛋白的要求,为进一步深入研究Kinectin在肝癌发生发展中的作用奠定基础。

肝癌相关抗原kinectin基因重组蛋白致敏的树突状细胞对T细胞增殖活化的影响

目的观察肝癌相关抗原kinectin基因重组蛋白(kinectin-MBP)致敏的树突状细胞(DC)对T细胞增殖活化能力的影响。方法从正常人外周血中分离单个核细胞,用rhGM-CSF、rhIL-4联合诱导扩增DC;用kinectin-MBP(kinectin-MBP组)、麦芽糖结合蛋白(MBP组)分别致敏DC,对照组不处理。采用ELISA法检测细胞上清液中的IL-12、IFN-γ,MTT法检测各组DC刺激自体T淋巴细胞增殖的能力。结果kinectin-MBP组上清液中IL-12、IFN-γ含量分别为(615.32±7.93)、(544.28±7.17)pg/ml,MBP组分别为(382.13±5.21)、(308.46±6.44)pg/ml对照组组分别为(299.40±10.22)、(228.03±6.70)pg/ml,三组相比,P均<0.05。kinectin-MBP组T淋巴细胞增殖指数为53.14±0.62,MBP组为22.14±0.31,对照组为10.86±0.65,三组相比,P均<0.001。结论体外诱导扩增的DC经kinectin-MBP致敏后具有很强的刺激自体T细胞增殖的能力。

肝癌相关抗原Kinectin蛋白致敏树突状细胞诱导的CTL对肝癌细胞株杀伤作用的检测

目的探讨肝癌相关抗原Kinectin基因重组蛋白Kinectin-MBP(MBP,麦芽糖结合蛋白)致敏树突状细胞(DCs)体外诱导特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)对肝癌细胞株的杀伤作用。方法体外基因工程的方法表达、纯化Kinectin-MBP。从正常人外周血中分离单个核细胞(PBMC),重组人粒细胞-巨噬细胞集落因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素4(rhIL-4)联合培养,诱导扩增DCs,并通过形态学、流式细胞术鉴定DCs。DCs经Kinectin-MBP致敏后,ELISA检测细胞上清液中IL-12和IFN-γ的含量;将致敏DCs与自体T淋巴细胞混合培养后,MTT法检测T细胞增殖的能力;同时诱导T细胞增殖转化为CTL,以此CTL为效应细胞,Kinectin表达阳性的肝癌细胞株bel-7404为靶细胞,LDH 4 h释放法检测CTL对肝癌细胞株的杀伤作用。结果体外重组蛋白技术成功表达、纯化出Kinectin-MBP。PBMC经rhGM-CSF和rhIL-4联合诱导,可成功培养出DCs。DCs经Kinectin-MBP致敏后上清液中IL-12和IFN-γ的分泌量明显增高,且刺激自体T细胞增殖的能力也显著增强;同时Kinectin-MBP致敏的DCs能明显诱导CTL的增殖,此CTL对Kinectin阳性的7404肝癌细胞株有较明显的杀伤作用,其杀伤率在效靶比为25∶1时达最高峰[为(65.00±1.47)%],显著高于其他对照组(均P<0.001)。结论体外诱导扩增的DCs经肝癌相关抗原Kinectin-MBP致敏后具有较强的刺激自体T细胞增殖的能力,且在体外可诱导同种CTL产生和增殖,后者对Kinectin阳性的7404肝癌细胞株具有较强的杀伤效应。该实验为将Kinectin蛋白运用于以DCs为基础的肝癌临床免疫治疗奠定了基础。

动力素kinectin基因mRNA在7404肝癌细胞株的表达及意义

目的研究动力素作为肝癌相关抗原其在肝癌细胞株中的表达情况,评价其作为分子肿瘤标记以及肿瘤免疫治疗特异性靶位的可能性。方法运用RT-PCR技术检测国内建株的肝癌细胞株BEL-7404 kinectin基因(D2剪接区)mR-NA的表达,并与肝癌组织、相应癌旁肝组织、正常肝组织比较。结果肝癌细胞株BEL-7404中kinectin基因(D2选择剪接区)呈强阳性表达,肝癌组织中也呈较强的阳性表达,癌旁肝组织则表达呈弱阳性。结论 kinectin基因可作为肝癌诊断的辅助分子标记,并具有作为肝癌免疫治疗特异性靶位的潜在价值。

重组Kinectin蛋白的表达、纯化及应用研究

目的优化重组kinectin蛋白的诱导表达及纯化条件;探讨用其致敏的树突状细胞(DC)对自体T淋巴细胞增殖能力的影响。方法以pMAL-C2为载体构建重组质粒,并转入TB1宿主菌。从IPTG加入时机、诱导温度、诱导时间及IPTG浓度方面对工程菌的诱导条件进行优化;过Amylose-resin亲和层析柱对诱导产物进行分离纯化。用获取的MBP-kinectin融合蛋白致敏从人外周血中分离培养的DC,并用ELISA检测细胞上清液中的IL-12、IFN-γ含量;再用MTT法检测致敏DC刺激自体T淋巴细胞增殖的能力。结果 工程菌在37℃振荡培养2个小时后加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG,降低温度到34℃继续诱导3个小时,可明显提高诱导效率;所得MBP-kinectin与DC共培养上清液中IL-12、IFN-γ含量分别为(615.32±7.93)pg/ml,(544.28±7.17)pg/ml,用其刺激的T淋巴细胞增殖指数为53.14±0.62,均高于麦芽糖结合蛋白(MBP)组和空白对照组,且差异有统计学意义。结论pMAL-C2载体可用于构建kinectin重组质粒;通过对诱导条件的优化,可获得较高的诱导效率;所得MBP-kinectin融合蛋白能致敏DC并具有很强的刺激自体T淋巴细胞增殖的能力。

Kinectin研究进展

KNT（kinectin）是内质网膜上的一种膜受体蛋白，完整的入KIN的相对分子质量为156×10^3，基因定位于14号染色体q22．1上，cDNA全长4．6kb，含有编码1364个氨基酸的开放阅读框絮。KNT除主要作为kinesin的受体参与细胞内囊泡转运外，还可以通过锚定延长因子1复合物到内质网上来调节真核细胞内蛋白的合成，可调节内质网活性膜扩张，参与了胰岛壁细胞中微管依赖激素的分泌过程，可抑制吞噬体沿微管双向运动。KNT与疾病存在相关性，如白塞病、肝细胞癌、再生障碍性贫血等。

KINECTIN与神经系统肿瘤的相关性研究

目的与方法:用分子生物学工程方法,表达和纯化kinectin蛋白作为抗原,用ELISA检测神经系统肿瘤、正常人和肝癌病人血清中kinectin抗体的阳性率。结果:正常人血清中kinectin检出率为5%,胶质瘤、脑膜瘤及垂体瘤患者血清中抗体检出率分别是43%、5%、3%,较肝癌病人血清中kinectin抗体检出率低(48%)。且检出率与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤分类和肿瘤分级无关。结论:kinectin与神经系统肿瘤有很强的相关性,可作为判定神经系统肿瘤的标志之一。

肝细胞癌相关抗原kinectin的血清学分析

肝细胞癌(Hepatoeellular carcinoma,HCC)为广西高发肿瘤,是死亡率最高的恶性肿瘤之一[1].目前HCC的诊断和治疗急待改善,其关键是找到免疫系统能识别的HCC肿瘤抗原.

经kinectin融合蛋白刺激的人B细胞诱导效应T细胞对肝癌细胞的杀伤

目的:探讨经人动力素(kinectin)融合蛋白刺激的人外周血B细胞诱导效应T细胞杀伤肝癌细胞的效果.方法:取健康人外周血,分离出单个核细胞,加B细胞刺激因子及kinectin麦芽糖融合蛋白进行体外培养,尔后用尼龙毛柱分离T细胞,将其与肝癌细胞株7404混合培养.用乳酸脱氢酶法检测杀伤肝癌细胞的活性.结果:T细胞对肝癌细胞的杀伤率:空白对照组:3.40%±0.27%;实验组:38.48%±2.64%;阴性对照组:13.03%±2.38%.经统计软件分析,实验组杀伤率与其他组有明显差异.结论:经kinectin融合蛋白刺激的人外周血B细胞诱导的效应T细胞在体外对肝癌细胞株7404有杀伤的作用.

白塞病相关自身抗原Kinectin的表达型cDNA文库筛选与鉴定

目的研究白塞病患者血循环中的自身抗体及其针对的细胞内靶抗原。方法应用免疫印迹-化学发光法对39例白塞病患者血清进行初步研究,以含有高滴度抗体的患者血清作为“探针”免疫筛选表达型!ZAP噬菌体cDNA文库并鉴定候选克隆,通过真核转录、翻译以及免疫沉淀实验分析阳性克隆表达产物的抗原性。结果文库筛选获得6个独立候选克隆,均为人Kinectin部分全长cDNA,以其中最大克隆的基因表达产物为抗原基质的免疫沉淀研究显示,23.1%(9/39)的白塞病患者血清呈阳性反应,正常人以及系统性红斑狼疮、干燥综合征患者对照阴性。结论Kinectin是白塞病相关自身靶抗原;抗Kinectin抗体与白塞病免疫发病机制的关系值得深入探索,抗体可能对疾病具有潜在血清学诊断价值。

抗Kinectin抗体与白塞病相关性研究

目的 研究抗kinectin抗体与白塞病的关系。方法 从人喉癌上皮细胞 (Hep2细胞 )抽提RNA ,利用反转录 聚合酶链反应 (RT PCR)扩增碱基序列相当于kinectin的氨基酸 5 0 3～ 994(kin m)和氨基酸 92 0～ 1346 (kin 3)两个片段 ,并克隆到pET4 2 a(+)载体中。诱导表达的融合蛋白经纯化后建立酶联免疫吸附试验 (ELISA)方法 ,并对白塞病患者血清进行分析。结果 构建的表达kinectin载体能在大肠杆菌中表达具有抗原性的肽段 ,用纯化的融合蛋白建立检测抗kinectin抗体的ELISA方法 ,对 4 6例白塞病患者、118例其他自身免疫病患者及 5 1名正常人检测显示kinectin抗体阳性率分别为白塞病 6 3% (2 9/ 4 6 ) ,系统性红斑狼疮 2 2 % (8/ 37)、类风湿关节炎 16 % (5 / 31)、干燥综合征 4 1% (11/ 2 7)、混合性结缔组织病 2 9% (4 / 14 )。与 118例其他自身免疫病相比 ,白塞病中抗kinectin抗体的检出率明显升高 (P <0 0 1)。结论 Kinectin是白塞病的相关抗原 ,在其他自身免疫病中也可检测到该抗原抗体 ,其意义有待进一步研究。

kinectin抗体免疫荧光检测方法的建立与应用

目的 探讨kinectin蛋白在真核细胞的定位 ,并建立kinectin抗体免疫荧光检测方法(IFA)。方法 从人喉癌上皮细胞 (HepG2 )抽提RNA ,用逆转录聚合酶链反应扩增kinectin编码区序列 ,并连接到真核表达载体pEGFP C2中 ;将构建的 pEGFP kinectin载体导入HepG2细胞中 ,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白 (GFP)的荧光及其细胞定位。然后 ,用此转染细胞制成的底片 ,建立检测kinectin抗体的IFA。同时用IFA对 5 1名正常人及 4 6例白塞病 (BD)患者血清进行初步检测。结果经EcoRI单酶切和测序证实 ,成功地构建了表达kinectin的真核表达载体 ;pEGFP kinectin载体转染的细胞经 3次克隆筛选后 ,10 0 %的细胞胞浆内发出特征性荧光。用kinectin抗体阳性血清染色 ,也得到类似特征的荧光。IFA检测显示 ,BD患者kinectin抗体的阳性率为 32 7% ( 15 /4 6 ) ,正常人均为阴性。结论 构建kinectin表达的载体可在HepG2细胞中进行表达 ,并成功地用 pEGFP kinectin转染的HepG2细胞建立了检测kinectin抗体的IFA。

再生障碍性贫血患者抗Kinectin和抗Moesin抗体表达与IST疗效相关性的初步研究

再生障碍性贫血（aplastic anemia,AA）是临床常见的骨髓衰竭性疾病,免疫抑制治疗（immunosuppressive therapy,IST）是目前主要的治疗策略。但临床治疗中仍有20%~30%的AA患者对IST疗效不佳,AA患者自身具有的细胞、体液免疫特点与IST疗效是否存在一定关系,是临床研究中值得探讨的问题。驱动结合蛋白（Kinectin）是真核细胞生物进化上的保守蛋白质，在白塞病、多种自身免疫结缔组织疾病中表达，对疾病的诊断及预后具有重要的价值。

lncRNA KTN1-AS1调节miR-153-3p/NFAT5轴对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的探讨长链非编码RNA Kinectin 1反义RNA 1(lncRNA KTN1-AS1)调控miR-153-3p/活化T细胞核因子5(NFAT5)轴对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western blot分别检测NSCLC组织、癌旁组织、人正常肺上皮细胞BEAS-2B及NSCLC细胞系A549、HCC827、H1299中KTN1-AS1、miR-153-3p表达及NFAT5蛋白表达;将A549细胞分为Ct组、si-NC组、si-KTN1-AS1组、mimic NC组、miR-153-3p mimic组、miR-153-3p mimic+pcDNA组、miR-153-3p mimic+pcDNA-NFAT5组,qRT-PCR检测细胞中KTN1-AS1、miR-153-3p表达;CCK-8法检测细胞增殖;平板克隆实验检测细胞克隆形成能力;划痕愈合实验检测细胞迁移;Transwell检测细胞侵袭;Western blot检测NFAT5、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表达;双荧光素酶验证KTN1-AS1与miR-153-3p、miR-153-3p与NFAT5的关系。结果在NSCLC组织和细胞中,KTN1-AS1、NFAT5蛋白高表达,miR-153-3p低表达,且在A549细胞中KTN1-AS1、NFAT5蛋白表达最高,miR-153-3p表达最低(P<0.05),因此,选择A549细胞为研究对象;与si-NC组比较,si-KTN1-AS1组KTN1-AS1、NFAT5蛋白表达降低,miR-153-3p表达升高(P<0.05);与mimic NC组比较,miR-153-3p mimic组KTN1-AS1表达量变化差异不显著(P>0.05),NFAT5蛋白表达降低,miR-153-3p表达升高(P<0.05);与miR-153-3p mimic组、miR-153-3p mimic+pcDNA组比较,miR-153-3p mimic+pcDNA-NFAT5组KTN1-AS1、miR-153-3p表达量变化差异不显著(P>0.05),NFAT5蛋白表达升高(P<0.05);下调KTN1-AS1或上调miR-153-3p均可抑制A549细胞增殖、迁移、侵袭及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达;过表达NFAT5减弱了上调miR-153-3p对A549细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用;KTN1-AS1靶向调控miR-153-3p/NFAT5轴。结论沉默KTN1-AS1可能通过上调miR-153-3p来抑制NFAT5表达,进而抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭。

白塞氏病相关抗原的重组表达及抗原性初步分析

目的 :探讨Kinectin的抗原性 ,为下一步研究Kinectin在白塞氏病中的意义奠定基础。方法 :从人Hep2细胞抽提RNA ,利用RT PCR扩增能覆盖Kinectin全长的 3个片段 ,其位置分别相当于氨基酸 2 2～ 5 10 (kin 5 ) ,5 0 3～ 994 (kin M)和 92 0～1346 (kin 3)。将扩增的PCR片段克隆到pET4 2 a(+)载体中 ,诱导表达的融合蛋白用白塞氏病病人血清进行Westernblot分析。结果 :构建的 3个表达Kinectin部分片段载体 (pET kin 5、pET kin M和pET Kin 3)具有正确的阅读框架 ,DNA测序符合率为99 % ,能在大肠杆菌中表达相应的肽段。 8份阳性血清中 ,用Westernblot分析发现 ,6份血清与kin M反应 ,5份血清与kin 3反应 ,只有一份血清与kin 5有反应。结论 :成功地构建表达覆盖Kinectin全长的 3个载体 ,并初步发现Kinectin的抗原性可能主要位于其中间段和羧基端。

再生障碍性贫血免疫损伤机制及相关淋巴细胞的研究

再生障碍性贫血的发病机制还未完全明确,其研究进展不断有所报道。随着对其发病机制研究的不断深入和对临床经验的不断总结,除外T淋巴细胞免疫功能紊乱,B细胞介导的体液免疫紊乱和再生障碍性贫血的关系也逐渐受到重视,特别是和再障相关的体液因子。现在就这方面作一综述,希望能为实验研究及临床治疗提供更多的思路。

肝癌相关抗原动力素蛋白D2和D3选择剪接区在广西人肝癌组织表达的差异性研究

目的观察动力素蛋白（kineetin）D2、D3选择剪接区（简称D2、D3区）在广西人肝癌组织、癌旁组织以及正常肝组织中表达的差异性，探索kinectin的选择剪接区与肝癌发生之间可能存在的联系。方法在广西医科大学第一附属医院肝胆外科收集45例广西籍肝癌患者癌组织与相应癌旁组织标本，以及10例正常肝组织标本，采用半定量PCR法检测D2、D3区表达的差异性，并进行统计学分析。结果D2L/D2S（包含D2区的长片段／不包含D2区的短片段）表达比值肝癌组织为2．709±1．025，癌旁组织为1．564±0．357，正常肝组织为1．507±0．499，组间比较差异有统计学意义（F=29．698，P〈0．05），其中肝癌组织D2L／D2S表达比值明显高于癌旁组织和正常肝组织（P均〈0．05）；D3L／D3S（包含D3区的长片段／不包含D3区的短片段）表达比值肝癌组织为1．232±0．041，癌旁组织为1．156±0．309，正常肝组织为1．282±0．343，组问比较差异无统计学意义（F=0．989，P〉0．05）。结论包含D2区的kinectin异型体在肝癌组织中有过度表达，提示其可能与肝癌的发生有一定的相关性．