大鼠野生型钾通道亚基Kir2.3基因真核表达载体的构建及其在PC12细胞中的表达

目的:克隆大鼠野生型钾通道亚基基因Kir2.3并构建真核表达载体pcDNA3-flag/Kir2.3,观察其在大鼠嗜铬细胞瘤(PC12)细胞中的表达。方法:从成年大鼠纹状体中提取总RNA,用RT-PCR方法获得大鼠野生型Kir2.3基因的全长cDNA,经限制性内切酶双酶切后,克隆至真核表达载体pcDNA3-flag质粒中。Kir2.3基因测序结果与基因库登录序列比对,序列正确的重组质粒用脂质体转染PC12细胞,Western blot和荧光显微镜观察基因表达情况。结果:Kir2.3基因测序结果与基因库登录序列比对显示完全一致。Western blot证实pcDNA3-flag/Kir2.3转染PC12细胞24 h后有Kir2.3的过表达,且至少持续72 h。结论:成功构建了大鼠野生型Kir2.3基因的真核表达载体,获得了瞬时表达大鼠野生型Kir2.3基因的PC12细胞克隆,为进一步研究Kir2.3的生物学功能以及Kir2.3在帕金森病发病机制中的作用奠定了良好的基础。

应用Q-PCR定性检测KIR基因有无方法的建立

目的建立定性检测KIR基因有无的Q-PCR方法。方法根据高分辨水平中国人群KIR等位基因的多态性,并参考国际IPD-KIR数据库,针对16种KIR基因及2DS4-Normal、2DS4-Deleted两种亚型,设计KIR基因特异性引物用于Q-PCR扩增反应;同时设置一孔阴性对照、一孔阳性对照(特异性扩增人体生长激素HGH基因片段),以监控假阳性、假阴性的结果。为验证Q-PCR方法的可靠性,随机选择302份已采用KIR PCR-SSP商品化试剂盒检测的标本,采用Q-PCR方法盲检和对比。结果300人份的Q-PCR检测结果与已知的PCR-SSP检测结果相符,有2份标本结果不一致,其中1例标本的2DS5基因Q-PCR检测结果为阴性,而PCR-SSP检测结果为阳性;另一例标本2DS1基因Q-PCR检测结果为阳性,而PCR-SSP检测结果为阴性。对2份标本分别进行2DS5、2DS1基因测序分型,证实Q-PCR定性检测结果正确。结论本文建立的KIR Q-PCR方法结果准确、可靠,可用于KIR基因有无的定性检测。

慢性颞叶癫大鼠海马内向整流钾通道Kir2.3 mRNA的动态变化

目的探讨慢性颞叶癫大鼠海马不同时间点内向整流钾通道Kir2.3mRNA的表达变化及Kir2.3通道与颞叶癫发病机制之间的关系。方法匹罗卡品诱发大鼠产生癫持续状态(statusepilepticus,SE),经过2周成模为慢性颞叶癫大鼠。以SE终止后0h、6h、72h和2周作为时间点,分别用RT-PCR方法检测致痫大鼠海马中Kir2.3通道mRNA的表达变化。结果正常对照组、SE终止后0h、6h、72h、2周各时间点Kir2.3mRNA与β-actin比值分别为0.080±0.030、0.103±0.045、0.164±0.026、0.132±0.024和0.011±0.008,其中6h组比值增高,和对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05);2周组比值的降低,和对照组比较差异亦具有统计学意义(P<0.05)。结论离子通道的改变可能是一个动态变化的慢性过程。在致痫大鼠SE发生2周后,即转入慢性自发性癫发作时,可能是Kir2.3通道表达发生变化的转折点,从而成为痫性发作的基础。

Flow-rSSO及PCR-SBT方法检测KIR基因有无的对比研究

目的研究流式磁珠序列特异性寡核苷酸探针(Flow-rSSO)杂交及测序分型(PCR-SBT)方法鉴定KIR基因有无的一致性。方法对131例汉族人群的DNA标本采用Flow-rSSO方法鉴定全部16种KIR基因的有无,并采用本实验室建立的PCR-SBT方法对14种功能性KIR基因进行高分辨水平基因检测;分析Flow-rSSO及PCR-SBT两种方法鉴定14种功能性KIR基因有无的一致性。对初检结果不一致的标本,采用同一厂家、不同批号的Flow-rSSO试剂盒进行复检,并采用序列特异性引物-PCR(PCR-SSP)方法进行检测。结果131例标本中有129例完全一致,2例不一致,占1.5%(2/131)。不一致的两例标本,1例标本3DL1基因、另1例标本2DS3及2DS5基因,其Flow-rSSO初检结果均为阴性,而PCR-SBT结果均为阳性。更换新的批号Flow-rSSO试剂盒复检,两例标本的结果均为阳性;采用PCR-SSP方法检测的结果亦为阳性。结论经Flow-rSSO试剂盒检测KIR基因有无,出现2例标本初检结果错误,提示检测KIR基因有无时,试剂的质控工作至关重要。

广西猪瘟病毒变异株分离鉴定及其E2基因遗传特性分析

【目的】明确猪瘟病毒(CSFV)广西分离株的分子流行病学特点和病原学特性,为科学使用CSF疫苗及有效防控广西CSFV流行提供参考依据。【方法】2019年12月—2020年10月,从广西南宁、隆安、柳州、百色及北海等地采集疑似CSFV感染的流产胎儿、死胎、木乃伊胎和弱仔猪的组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和淋巴结等)进行CSFV检测,通过PK-15细胞进行病毒分离,采用RT-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)进行鉴定,克隆CSFV分离株E2基因,经DNASTAR进行核苷酸序列及推导氨基酸序列同源比对分析后以MEGA 6.0构建遗传进化树;同时以Shimen标准株为对照,检测感染PK-15细胞后分离株的生长曲线、病毒mRNA和E2蛋白水平。【结果】从104份疑似CSFV感染样品中分离出1株CSFV,命名为GXNN2019-13,接种至PK-15细胞后并未出现细胞病变。GXNN2019-13株与我国Shimen标准株(强毒)和HCLV株(弱毒)的E2基因核苷酸序列相似性较低,分别为84.6%和83.5%,而与日本CSF0745株及德国CSF0496和Alfort Tuebingen株的相似性分别为93.9%、92.2%和91.5%;GXNN2019-13株与Shimen和HCLV株的E2氨基酸序列相似性分别为89.3%和88.7%,与日本CSF0745株及德国CSF0496和Alfort Tuebingen株的相似性分别为95.5%、94.6%和93.8%;以HCLV株为参照进行多序列比对,发现GXNN2019-13株E2蛋白较Shimen标准株的变异程度更高。感染PK-15细胞后,GXNN2019-13株的病毒复制能力弱于Shimen标准株,生长曲线上各时间点的病毒效价及mRNA水平均低于Shimen标准株。【结论】从疑似CSFV感染病料分离获得的GXNN2019-13株属于2.3亚型中的独立小分支,与之前的广西分离株亲缘关系较远,可能是新的变异毒株,其复制能力弱于Shimen标准强毒株。

浙江汉族人群杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多态性研究

本研究的目的是分析浙江汉族人群杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因的多态性及基因型。采用序列特异性引物PCR法(PCRSSP)进行KIR基因低分辨率检测和基因型分析。结果表明:①在浙江汉族人群中共检出目前已知的17个KIR基因。2DL4、3DL2和3DL3基因存在于所有个体,其基因频率为1.00。2DL1、2DL3、2DP1、3DP1003、3DL1、2DS4001/002基因较为常见,频率分别为0.902、0.902、0.902、0.902、0.7598、0.5615;而2DL2、2DL5A、2DL5B、2DS1、2DS2、2DS3、2DS4003、2DS5、3DS1和3DP1001/002基因频率较低。②浙江汉族人群中以A型单倍型为主,频率高达74.7%。在检测样本中共明确检出12种单倍型,最常见的是单倍型2,频率为53.0%。③共检出26种基因型,最常见为AJ(2,2)、AF(1,2)型,其次为AH(2,5)、NN2(2,6)、AI(1,5)和AG(1,1)。其中有15种基因型在白人中尚未见报道,4种基因型无法根据相关文献标准分析出单倍型。结论:浙江汉族人群有其独特的KIR基因频率和基因型频率分布。

PKC对两种表达系统中内向整流性钾通道调节的不同及机制研究

目的分别在蛙卵细胞和COS-7细胞中表达Kir2.3通道,观察PKC的激动剂PMA对两种细胞中表达的Kir2.3通道电流调节的不同,并通过共聚焦显微镜扫描方法研究PIP2水解在PKC调节这两种细胞中Kir通道的作用。方法用显微注射方法和磷酸钙介导的质粒DNA细胞转染法分别将Kir2.3通道表达于蛙卵细胞和培养的COS-7细胞中,用双电极电压钳方法和全细胞电流膜片钳记录法检测PMA对两种细胞中表达的Kir2.3通道电流的作用。用共聚焦显微镜扫描法检测细胞膜PIP2水解。结果在蛙卵细胞的双电极电压钳实验中,PMA能够明显抑制蛙卵细胞中表达的Kir2.3通道的电流,而PMA不能抑制COS-7细胞中表达的Kir2.3通道的电流。激光共聚焦扫描的方法结果发现PMA不能使COS-7细胞膜上的PIP2水解,这一结果同细胞电生理的结果相一致。提示了PIP2的水解在PKC对Kir通道的调节过程中起重要的作用。结论PMA通过激活PKC抑制表达于蛙卵细胞中的Kir2.3电流而对表达于COS-7细胞中的Kir2.3电无作用;PMA可促进蛙卵细胞中的PIP2水解,而对COS-7细胞中的PIP2无影响;因此,PIP2的水解在PKC对Kir通道的调节中可能起着重要的作用。

云南汉族人群KIR基因多态性研究

目的分析云南汉族人群杀伤细胞免疫球蛋白样受体(K IR)基因的多态性及基因型和单倍型特点。方法从献血者中随机选择150名无亲缘关系的云南汉族健康志愿者,采用序列特异性引物PCR法(PCR-SSP)对其进行KIR基因低分辨率检测,并根据Hsu等[5]的标准进行基因型和单倍型分析。结果在云南汉族人群中共检出目前已知的17个KIR基因,其中3DL3、2DL4、3DP1和3DL2框架基因存在于所有个体。2DL1、2DL3、2DP1、3DP1*003、3DL1、2DS4*001/002基因较为常见,而2DL2、2DL5A、2DL5B、2DS1、2DS2、2DS3、2DS4*003、2DS5、3DS1和3DP1*001/002基因频率较低。在云南汉族人群中共检出31种基因型,最常见基因型为AJ(2,2)和AF(1,2)型,频率分别为26.67%和17.33%。同时检出15种单倍型,以单倍型2最为常见,频率为47.3%。此外,还发现2种新基因型目前在其他人群中尚未见报道,3种基因型无法根据Hsu等[5]的标准模式分析出单倍型。结论云南汉族人群K IR基因分布表现出中国汉族人群K IR多态性的一些共同特点,同时具有其独特的KIR基因频率、单倍型频率和基因型频率分布。

中国北方人群系统性红斑狼疮患者KIR基因多态性的研究

目的:检测和分析系统性红斑狼疮患者的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因的多态性,探讨系统性红斑狼疮(SLE)从基因到临床表达的发病机制。方法:应用PCR-SSP技术检测北方62例确诊SLE患者和61例同一区域同一民族正常对照者的KIR基因位点多态性。结果:SLE患者KIR基因表型分布较常见的为KIR3DP1、2DL1、2DP1、3DL1、2DL3及1D,其次为2DS4、2DL5、3DS1、2DS2、2DS5和2DL2,较低者为2DS1、2DS3及3DP1V,SLE病例组KIR3DS1,2DL2、2DL5和2DL3基因型频率比对照组显著降低(P<0.01)。结论:中国北方人群的SLE的发生可能与多个KIR基因等位基因有相关性。

拉萨地区藏族人群KIR基因多态性研究

目的了解拉萨地区藏族人群16个KIR基因的多态性。方法从拉萨无偿献血者中选取224名拉萨地区藏族健康自愿者,采用多重PCR-SSP方法进行KIR基因检测。根据http://www.allelefrequencies.net/中的ID号命名基因型和单体型组成。结果在拉萨地区藏族人群中,框架基因KIR3DL2、3DL3、2DL4和3DP1存在于所有个体;较为常见KIR基因有3DL1、2DL1、2DL3、2DP1和2DS4,其基因频率分别为0.836 3、0.905 7、0.884 2、0.905 7和0.810 3;频率较低的基因有KIR2DS1、2DS2、2DS3、2DS5、3DS1、2DL2和2DL5,其基因频率分别为0.201 0,0.134 0,0.064 6,0.170 8,0.195 5,0.131 4,0.215 1;共发现20种KIR基因型,其中以ID号为1和2的基因型最为常见,频率为52.68%和15.63%。结论拉萨地区藏族人群KIR基因分布与中国南方汉族人群之间较一致。

转天山雪莲冷调节蛋白基因烟草的获得及其抗寒性鉴定

从已建立的天山雪莲cDNA文库中随机挑取单克隆,采用通用引物M13扩增出基因序列并测序,然后将该序列在GenBank中进行比对,根据该序列设计特异引物进行PCR,最终获得了冷调节蛋白基因siCOR的完整开放读码框(ORF);构建植物表达载体,通过农杆菌介导法获得转基因烟草,用RT-PCR对转化烟草进行鉴定,收取种子后筛选出纯合的T3株系,并通过冷冻胁迫进行抗寒性分析。结果表明:(1)siCOR大小661bp,与禾本科植物粳稻的冷调节蛋白基因一致性最高(65.04%)。(2)与野生型植株相比,转siCOR基因烟草均叶片浓绿、无分支侧芽,生长快;在冷冻胁迫条件下,转siCOR基因的烟草叶片相对含水量、PSⅡ相对量子产率降低幅度、相对电导率和丙二醛含量的升高幅度均低于野生型烟草植株,而且转siCOR基因烟草植株叶片出现萎蔫症状的时间较迟、程度较轻,受到的伤害也较轻。研究发现,在冷冻胁迫条件下,转siCOR基因烟草植株表现出良好的生理和生长优势,显示出了较强的抗寒特征。

白血病患者的杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多态性研究

本研究检测白血病患者的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulin-like receptors,KIR)基因的多态性,探讨KIR基因的多态性与白血病发生的关联性。应用PCR-SSP技术对北方地区50例白血病患者和60名健康对照者进行KIR基因的检测和分析。结果表明:共检出目前已知的18个KIR基因,在检测的全部个体中,3DL3,3DL2及2DL4出现频率均为100%,其余依次为3DP1、2DP1、2DL3、3DL1、2DL1、3DS1、2DL5、2DS4、2DS2、1D、2DS5、2DL2、2DS1、2DS3和3DP1v。与正常对照组比较,白血病患者的3DL和2DL1的基因频率(0.60)和(0.57)比对照组(1.00)显著降低(P<0.01)。结论:KIR基因的多态性与白血病的易感性有较为密切的关系。

天山雪莲LEA14基因克隆及功能分析

从天山雪莲叶片低温诱导的EST文库中获得了1个胚胎发育晚期丰富蛋白基因(LEA)cDNA全长序列。序列分析表明,该基因含有1个468bp编码155个氨基酸的开放阅读框。NCBI保守域预测此蛋白属于LEA_2家族,命名为SiLEA14。系统进化分析表明,该蛋白与北柴胡的LEA-2蛋白亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,SiLEA14表达量在低温、盐和干旱胁迫条件下迅速升高。亚细胞定位结果表明,SiLEA14蛋白定位于细胞核中。利用农杆菌介导法将该基因导入烟草,测定并分析转基因植株在冷冻和盐胁迫处理下的生理指标,结果表明,SiLEA14基因在烟草中的过量表达提高了烟草的抗冻和耐盐能力。

HLA-Cw在广东汉族人群中的分布频率及其意义的初步分析

目的 :检测HLA Cw在广东汉族人群的分布频率 ,初步分析该人群中KIR与HLA Cw之间识别方式的特点及意义。方法 :骨髓移植供者 12 2例 ,ACD抗凝血提取DNA ,半量全自动PCR RSSO分型检测Cw。结果 :广东汉族人群HLA Cw基因频率分布由高至低依次为 :Cw 0 3(0 2 371) >Cw 0 7(0 2 15 9) >Cw 0 1(0 175 2 ) >Cw 0 8(0 112 9) >Cw 0 4 (0 0 5 0 5 ) >Cw 14、15(0 0 4 19) >Cw 12 (0 0 376 ) >Cw 0 6 (0 0 333) >Cw 0 5 (0 0 0 82 ) >Cw 16 (0 0 0 4 1)。第一组Cw 0 2 ,0 4 ,0 5 ,0 6识别KIR分子中2DL 2DSI;第二组Cw 0 1,0 3,0 7,0 8识别KIR分子中 2DL2 2DL3;2DS2 2DS3。两组分布频率相比有显著性差异 (P <0 0 1)。结论 :广东汉族人群HLA Cw 0 1,0 3,0 7,0 8出现频率较高 ,其与KIR的识别方式均属第二组。

中国江苏地区汉族人群杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因的多态性

本研究探讨杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulin-like receptor,KIR)在江苏汉族人群中的分布规律。用PCR-SSP方法对江苏地区269名汉族非亲缘健康人群行KIR基因分型。结果表明:在江苏人群中检出了目前已知的所有KIR基因,共发现江苏汉族人群KIR基因型34种;15种基因型在浙江和香港人群中亦有报道(AA1、BX2、BX3、BX4、BX5、BX6、BX8、BX9、BX11、BX13、BX33、BX68、BX69、BX70、BX75);19种基因型未见于浙江和香港人群(BX10、BX12、BX17、BX23、BX26、BX27、BX28、BX31、BX35、BX42、BX47、BX57、BX72、BX74、BX79、BX154、BX188、BX231、BX370)。在江苏汉族人群中发现仅在希腊人群中罕见的基因型BX42和仅在瑞典人群罕见的基因型BX231,及仅在马其顿人群中罕见的基因型BX370。结论:在江苏汉族人群中检出了目前已知的所有的16个KIR基因,总计发现了KIR基因型34种,其中BX42、BX231和BX370是罕见的KIR基因型。

山东地区汉族人群KIR基因多态性分析

目的分析山东地区汉族人群杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因多态性及基因型和单倍型多态性,为进一步研究KIRs与疾病的关系奠定基础。方法采用序列特异性引物PCR法(PCR-SSP)对412例山东地区无血缘关系的汉族健康志愿者进行KIR基因频率检测及基因型和单倍型分析。结果①KIR基因频率:可检测到目前已知的18种KIR基因;所有个体均检测到3个框架基因(2DL43、DL2、3DL3)以及KIRZ,其基因频率均为100%。3DP12、DL3、2DL1、3DL1和2DS4基因较为常见,频率分别为99.03%、98.79%、98.79%、98.79%、96.84%;而2DL2、2DS23、DP1v基因频率较低。②KIR基因型频率:共检出基因型28种,以AJ(2,2)、AF(1,2)型最常见,其次为AH(5,2)、G(4,5)、AI(1,5);另外有11种基因型在白人中尚未见报道。③KIR基因单倍型频率:共检出单倍型16种,最常见的是单倍型2,频率为46.36%;其次为单倍型1,频率为25.61%。结论山东地区汉族人群有其独特的KIRs基因频率、基因型频率和单倍型频率分布;本研究可为进一步研究KIRs与疾病的相关性提供依据。

河北地区汉族人群KIR基因多态性研究

目的调查河北地区汉族人群杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的基因频率分布情况。方法收集河北地区无血缘关系汉族人群血液样本288份,采用PCR-SSP法检测KIR基因型,统计基因频率。结果河北地区汉族人群中KIR框架基因2DL4、3DL2、3DL3、3DP1的基因频率均为100.00%,2DL1、2DL3、3DL1、2DS4、2DP1的频率较高,均>92.00%,而2DL2、2DS2、2DS3、2DS5的频率则较低;在河北汉族人群中共发现51种组合型,KIR组合型2DL4+3DP1+3DL2+3DL3+2DL1+2DL3+2DP1+3DL1+2DS4所占比例最大,约为43.75%。结论河北汉族人群中KIR基因频率与其他亚洲人群相似,不同于其他民族。KIR组合型2DL4+3DP1+3DL2+3DL3+2DL1+2DL3+2DP1+3DL1+2DS4所占比例最大。

江西省汉族人群KIR基因表达频率分析

目的:分析江西省汉族人群杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer cell immunoglobulin-like receptor genes,KIR)基因分布,对150名汉族健康人KIR基因进行多态性分析。方法:采用序列特异性引物PCR法(PCR-SSP)对江西地区人群进行KIR基因表型检测,统计不同KIR基因在人群中的表现频率。结果:在江西人群中,3DL3、3DL2、2DL4基因存在于所有个体,KIR2DL3、KIR2DS4、KIR2DS4、KIR2DP1、KIR3DL1基因比较常见,KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL5、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS5、KIR3DS1比较少见。结论:江西人群中检出了目前已知的所有16个KIR基因,与中国其他地区的汉族人群表达频率相似,同时也具有独特性。

Kir 4.1基因沉默对U-251细胞周期的影响

目的:针对人内向整流性钾离子通道(inwardly rectifying potassium channel protein,Kir)4.1基因构建si RNA干扰载体,探讨其对U-251细胞增殖、生长的影响,为临床治疗及开发新的抗肿瘤药物提供实验依据。方法:采用细胞培养、质粒转染、流式分选、RT-PCR、Western blot及流式细胞仪对构建的质粒进行鉴定并观察对照组和干扰组细胞周期的变化。结果:对DH5α中抽提的重组载体测序验证结果和插入序列一致;成功筛选出一个有效质粒;质粒转染U-251细胞后,细胞周期中的G2期细胞数量由19.39%降至1.5%,明显减少(P=0.018),S期细胞数量由36.32%升至51.22%,明显增多(P=0.027)。结论:成功构建针对人Kir 4.1基因的si RNA干扰载体;Kir 4.1干扰载体可能是通过抑制U-251细胞周期中的G2期,使U-251细胞的生长停滞在S期,从而达到干扰U-251细胞的增殖能力。

短片段扩增KIR基因的PCR-SSP分型法的建立及其应用

目的建立短片段扩增杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因的序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)分型法。方法选取330例湖南汉族健康志愿者血液标本,提取基因组DNA;合成短片段扩增KIR基因的序列特异性引物,采用PCR-SSP分型法扩增已知的16个KIR基因,分析湖南汉族人群KIR基因的频率分布特征。从330例DNA标本中随机选取100例,比较长、短片段扩增KIR基因的PCR-SSP分型法检测基因的阳性率差异。结果①短片段扩增KIR基因的PCR-SSP分型法可检测出所有KIR基因,扩增产物条带清晰,结果准确;②湖南汉族健康人群KIR2DL4、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR3DP1基因阳性率均为100%,KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR2DS4、KIR2DP1基因阳性率分别为96.4%、96.1%、94.2%、94.2%和99.7%,而KIR2DS1、KIR2DL5、KIR3DS1、KIR2DL2、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS5基因阳性率均<40%;③长、短片段扩增KIR基因的PCR-SSP分型法(长、短片段方法)均可检测出16个KIR基因,且KIR2DL3、KIR2DL4、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR3DP1基因的阳性率一致,但长片段方法检测其余KIR基因的阳性率均低于短片段方法,其中短片段方法检测KIR3DL1、KIR2DS1、KIR2DS4、KIR3DS1基因阳性率均明显高于长片段方法(分别为94%vs.84%、40%vs.26%、94%vs.62%、38%vs.20%,均P<0.05),同时漏检和误检降低。结论短片段扩增KIR基因的PCR-SSP分型法简单、易行、准确,具有良好的应用价值。