副结核分枝杆菌重组酶介导扩增-侧向流试纸条检测方法的建立与初步应用

旨在建立一种副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis,MAP)精准快速的检测方法,结合重组酶介导扩增(recombinase-aid amplification,RAA)和侧向流试纸条(lateral flow dipstick,LFD)技术,以MAP的特异性多拷贝插入元件IS900设计引物和探针,通过优化反应时间和温度等条件,建立可用于MAP现场可视化检测的RAA-LFD方法。该检测方法在35℃条件下恒温反应30 min即可实现对MAP目的基因的有效扩增。试验结果显示:该方法可特异性地检测出MAP,不与其他常见的病原发生交叉反应;对MAP标准品的最低检测限可达到10 fg·μL^(-1);使用该方法对149份牛奶样品进行检测,与传统的PCR相比,其敏感性为100%。综上,本研究成功建立了一种针对于MAP的精准快速的试纸条检测方法,并具有广泛的应用前景。

RAA-LFD检测RHdV-2方法的建立

【目的】建立基于重组酶介导的核酸等温扩增(RAA)的侧流层析试纸条(LFD)方法,用于快速诊断兔出血症病毒(RHdV)2型(RHdV-2)。【方法】采用生物信息学软件分析RHdV-2、RHdV 1型(RHdV^(-1))基因组,筛选RHdV-2特异且保守的片段,设计RAA-LFD探针与特异性引物,以筛选最适引物及其浓度;对RAA-LFD检测的最适反应温度和时间进行优化,并对该方法的灵敏性、特异性、重复性进行评价及临床样品检测。【结果】同源性分析表明,RHdV-2的VP60基因存在特异且保守的序列。基于VP60基因设计3对引物,发现上游引物序列为5'-TCATTTGTACCCTTCAGCGGTACCACCATCC-3'、下游引物序列为5'-CCCGGCTGTTGTCTGGTTTATGCCATTT-3'的扩增效果最好,引物与探针混合液的最适浓度为5.000μmol·L^(-1)。用LFD-RAA方法检测RHdV-2的最适反应温度为39℃,最适反应时间为30 min。敏感性检测结果显示:以RHdV-2 VP60重组质粒为模板的最低检出量为6.7×103 ng·μL^(-1)。用建立的RAA-LFD方法对RHdV^(-1)的检测结果呈阴性,对RHdV-2的检测结果呈阳性,表明该方法的特异性良好。重复性检测结果显示,同一批次和不同批次试剂盒的检测结果均一致,表明重复性好。31份临床样品检测结果显示,5份为RHdV-2阳性样品。【结论】建立的检测RHdV-2的RAA-LFD方法具有简捷、易操作的特点,适合养殖场对RHdV-2的快速诊断。

RT-RAA联合CRISPR/Cas12a快速检测新型冠状病毒方法的建立与评价

目的建立一种基于反转录酶-重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)联合簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas12a系统的快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的方法,并对其进行评价。方法根据NCBI数据库中SARS-CoV-2的核衣壳(N)基因设计RT-RAA引物和CRISPR来源RNA(crRNA),优化检测体系中乙酸镁(MgAc)用量、RT-RAA反应温度和时间以及LbCas12a反应温度。以100~106 copies/μL重组质粒和其他呼吸道病原体分别评估该方法灵敏度和特异性。采用RT-RAA-CRISPR/Cas12a法和RT-PCR法对70份临床标本进行平行检测,比较两种方法的符合率。结果优化后的RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测方法可在37℃条件下50 min内完成SARS-CoV-2检测。荧光法检测灵敏度为10 copies/μL,侧流层析法为1×102 copies/μL。该方法能特异检测SARS-CoV-2,与其他呼吸道病原体无交叉反应。RT-RAA-CRISPR/Cas12a法检测70份临床标本的结果与RT-PCR法完全一致,符合率为100%。结论建立的RT-RAA-CRISPR/Cas12a法检测SARS-CoV-2快速、经济、灵敏度高、特异性强,无需昂贵仪器设备,可由经验不足的人员操作,为临床快速诊断和现场大规模筛查SARS-CoV-2提供了新的思路和方法。

锦鲤疱疹病毒RAA-LFD检测方法的建立

为建立一种简便、快捷的现地检测锦鲤疱疹病毒(KHV)的方法,本研究结合重组酶介导扩增(RAA)和侧向流试纸条(LFD)技术,根据RAA引物设计原则,以KHV Sph基因保守区为靶位点,设计5对引物并筛选出5号引物作为最优引物,在其下游引物、探针的5'端分别标记Biotin、FAM荧光基因。采用方阵法对RAA反应时间和温度等条件优化,结果显示,该检测方法在34℃~40℃恒温反应10 min即可实现对KHV目的基因片段的有效扩增,并且扩增产物结果可直接观察,由此初步建立了KHV的RAA-LFD检测方法。特异性试验结果显示,建立的RAA-LFD检测方法与鲤浮肿病毒(CEV)、鲫造血器官坏死病毒(CHNV)、流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、蛙虹彩病毒(BIV)等常见水生动物病原核酸均无交叉反应。敏感性试验结果显示,该方法对重组质粒标准品p EASY-KHV的检测限为50拷贝/μL,与行业标准常规PCR的敏感性相当。重复性试验结果显示,该方法对5份p EASY-KHV的检测结果均一致;对室温放置7 d的p EASY-KHV检测结果也均一致。采用该方法和常规PCR对60份临床样品检测,结果显示二者的阴性、阳性符合率以及总符合率均为100%。本研究首次建立了用于检测KHV的RAA-LFD方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好、操作方便,可用于KHV的临床样品检测,为KHV现地检测提供了一种简便、快捷的技术手段。

基于CRISPR/Cas12a系统的新型创伤弧菌试纸条检测方法的建立

创伤弧菌(VV)是一种重要的人畜共患和水生动物病原体,能引起人类和水生动物的弧菌病,严重影响人身健康和水产养殖业发展。快速、灵敏、准确的VV检测方法对于保障人民生命健康、降低水产养殖业损失至关重要。为建立一种新型VV检测方法,基于重组酶辅助扩增(RAA)技术和基于成簇的规律间隔的短回文重复序列和CRISPR相关蛋白12a(CRISPR/Cas12a)系统,构建了一种通过试纸条(LFS)读取VV检测结果的方法RAA-CRISPR/Cas12a-LFS。该方法不依赖精密仪器,通过肉眼读取LFS结果便可快速、灵敏、准确检测VV,检测限为10 copies/μL VV基因组DNA,检测时间约为60 min。此外,该方法具有高特异性,并可准确检出血液、粪便、虾类等加标样品中的VV。因此,所构建的VV检测方法RAA-CRISPR/Cas12a-LFS兼具简便、快速、灵敏、准确的特性,有望用于弧菌病早期诊断以及水产品VV感染/污染情况的现场检测。

两种基于重组酶介导扩增技术的沙门氏菌检测方法比较

该研究旨在利用重组酶介导扩增技术建立并比较两种食品中沙门氏菌快速检测方法。根据沙门氏菌菌毛蛋白fimY基因设计引物和探针,分别采用荧光法和侧向流试纸条法对扩增产物进行检测,构建重组酶介导等温核酸扩增方法,验证两种方法的特异性、灵敏度及对人工污染样品的检测效果。该研究构建的两种方法均在39℃下恒温运行,检测时间30~40 min,方法特异性良好,与大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌等常见的其他食源性致病菌无交叉反应,侧向流试纸条法灵敏度可达到1 pg/μL,荧光法灵敏度为10 pg/μL,对人工污染样品的检测结果与传统分离培养法检测结果一致。因此该研究建立了两种快速、特异、灵敏的方法用于检测沙门氏菌,为食品中沙门氏菌污染的快速筛查提供一定的参考价值和数据支撑。

致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌RAA-LFD快检方法的建立

为建立一种简单、快速的现场检测致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)的方法,根据VpAHPND pVA1质粒pirB基因保守序列设计RAA-nfo特异性引物和探针,建立了VpAHPND核酸RAA-LFD检测方法。该方法特异性强,仅对VpAHPND特定毒力株核酸检测为阳性,与副溶血弧菌非毒力株、霍乱弧菌、志贺氏菌、沙门氏菌、白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病病毒(IHHNV)、十足目虹彩病毒(DIV1)、虾肝肠胞虫(EHP)等病原核酸无交叉反应;灵敏度高,最低可检测到3.8×10^(2) CFU/mL的菌体细胞,质粒检测限为1.17×10^(1) copies/μL;检测时间短,37℃恒温反应20 min,以LFD显色5 min后即可完成结果判定;同时该方法具有良好的重复性和可信度,利用该方法和世界动物卫生组织(WOAH)推荐的qPCR方法平行检测58株副溶血弧菌分离株,二者符合率为100%。结果表明,本研究建立的RAA-LFD方法特异、灵敏、反应快速、操作简单且结果肉眼可视,适用于VpAHPND的现场快速检测。

鲤春病毒血症病毒RT-RAA-LFD检测方法的建立

为建立一种可现场快速准确检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)的方法,本研究结合重组酶介导扩增(RAA)和侧向流试纸条(LFD)技术,根据SVCV L基因保守区域设计引物及探针,通过优化反应时间和温度等条件,初步建立了可用于SVCV现场可视化检测的RT-RAA-LFD方法。优化后的检测方法在35℃水浴锅中恒温反应15 min即可实现对SVCV目的基因片段的有效扩增。结果显示,该方法可以特异性的检测SVCV,并且不与病毒性出血败血症病毒、传染性鲑鱼贫血症病毒、病毒性神经坏死病毒等其他常见鱼类病毒发生交叉反应;对SVCV重组质粒标准品的检测限为2.42×10^(2)拷贝/μL,并具有较好的稳定性和重复性;采用该方法和病毒分离、套式RT-PCR、荧光定量RT-PCR、荧光定量RT-RAA共5种方法同时对45份临床样品检测,其中病毒分离、套式RT-PCR和荧光定量RT-PCR均检测到29份阳性样品,荧光定量RT-RAA和本研究建立的方法均检测到28份阳性样品,本研究与前3种方法的阳性符合率为97.8%,与荧光定量RT-RAA的阳性符合率为100%。上述结果表明,本研究建立的SVCV RT-RAA-LFD检测方法简便快捷、特异性强、敏感性高、结果可靠,且不依赖于复杂的仪器,可适用于现场和实验室对SVCV的快速检测。

电场增强金属Al和Ni诱导非晶硅横向结晶

本文分析了Al和Ni在外加电场作用下诱导非晶硅(a-Si)薄膜横向结晶的特点和机理。对影响非晶硅结晶的诸多因素,如场强、金属种类和退火条件进行了研究。简要概述了金属诱导横向结晶(MILC)相对于其它一些结晶工艺的优势及其在薄膜晶体管(TFT)中的应用。指出适当强度的电场可显著加快横向诱导结晶的速率,但场强超过一临界值后,则降低该速率,并基于电迁移效应较合理地解释了该现象。

库区后期扶持时期的对口支援现状及对策分析

三峡工程的百万移民随着二期工程的结束,“搬得出”难题已经基本破解,对口支援在移民搬迁中发挥了巨大作用。而库区事关移民“稳得住,逐步能致富”发展大局的后期扶持工作,更是离不开全国各地的对口支援。本文在深入三峡库区一部分地区调研的基础上,提出了三峡库区借助新阶段对口支援战略促进后期扶持、建设和谐库区的一些对策建议。

非晶硅和非晶硅锗薄膜的金属诱导结晶

分析了金属Ni、Al诱导非晶Si及非晶SiGe薄膜结晶的条件、特点和机理。简要介绍了金属诱导结晶相对于其它一些结晶工艺的优势及其在薄膜晶体管中的应用。概述了影响诱导结晶速率和薄膜微结构的诸多因素,如热处理条件和外加电场等。对电场增强金属诱导横向结晶的相关问题进行了探讨,指出适当强度的电场可显著加快横向诱导结晶的速率,但更强电场则会降低该速率,基于电迁移效应对该现象进行了解释。

靖江市HIV感染者晚发现的影响因素

目的了解HIV感染者晚发现的原因。方法分析2010—2015年靖江市报告的新发HIV感染者相关资料,对患者社会人口学特征、高危行为、就医情况、艾滋病相关知识知晓情况、艾滋病相关政策知晓情况等进行调查,分析影响患者晚发现的相关因素。结果共报告102例确诊HIV感染者,36例为晚发现病例。单因素分析结果显示,男性、年龄大、家庭年收入低的患者晚发现的风险较高(P<0.05);感染途径与检测样本来源、对艾滋病相关知识的了解、对艾滋病相关政策的了解、艾滋病相关症状的发生与晚发现相关。多因素分析结果显示,不同家庭收入、检测样本来源,是否认为自己可能从固定性伴那里感染HIV、是否在查出感染HIV之前有做HIV检测的想法、是否有不明原因体重减轻(3个月内进行性体重下降超过10%)、是否有不明原因发热(间歇性或持续性超过1个月)、是否有口角炎、唇炎及口黏粘膜毛状白斑、是否了解偶尔共用针具注射毒品会传播HIV是影响艾滋病病毒感染晚发现的独立危险因素。结论影响HIV感染患者晚发现的因素较多,应加强健康教育和工作力度,争取尽早发现感染者。

髁突运动轨迹描记在垫治疗错中的应用

目的:探讨安氏Ⅱ类1分类(Ⅱ1)类错患者下颌左侧方运动时髁突运动轨迹的特征及其与正常之间的差异,并且应用髁突运动轨迹描记法评价垫治疗的效果。方法:随机选择正常40例(对照组)以及安氏Ⅱ1类错患者40例(试验组),其中应用垫治疗1个月者10例。应用髁突运动轨迹描记仪记录髁突运动轨迹。采用SAS统计学软件分析比较两组间是否存在统计学差异。结果:试验组左侧方运动中左右侧髁突最大空间位移[(12.19±2.12)mm和(13.36±1.31)mm]均显著大于正常组[(8.89±1.51)mm和(9.87±0.57)mm],P<0.05,非工作侧水平向和垂直向最大位移量[(3.07±0.64)mm和(8.18±0.51)mm]均显著大于正常组[(1.57±1.02)mm和(6.21±0.42)mm],P<0.05和0.01;髁突位移5 mm时左右侧矢状髁道倾斜度(sagittal condyle inclination,SCI)分别为(56.94±6.26)°和(60.64±8.04)°,左右侧水平髁道倾斜度(trans-verse condyle inclination,TCI)分别为(14.39±6.19)°和(15.21±6.89)°;均大于正常组[(45.27±6.53)°、(43.17±4.53)°、(3.01±1.39)°和(2.82±1.32)°,P<0.05和0.01。而在治疗前后工作侧及非工作侧结果差异无统计学意义(P>0.05)。结论:安氏Ⅱ1类错患者下颌侧方运动过程中髁突运动轨迹与正常有明显差异。垫治疗在1个月期间并不能明显改善安氏Ⅱ1类错患者的错。

高石灰石掺量水泥专用助磨剂试验研究

通过试验室模块试验和小磨试验,研究了高石灰石掺量水泥专用助磨剂对水泥的增强和助磨效果。结果表明,高石灰石掺量水泥专用助磨剂在9个新型干法水泥厂10个水泥样品的模块试验中28d抗压强度平均增加7.3MPa;小磨试验水泥45μm筛余减少3.8%～6.0%,3～32μm颗粒含量增加3.11%,28d抗压强度增加5.7～6.8MPa。高石灰石掺量水泥专用助磨剂同时具有显著的后期强度增强作用和助磨作用。

外加电场对金属诱导非晶硅横向结晶的影响

综述了Al和Ni在外加直流电场以及Cu在交流电场作用下诱导非晶硅(a-Si)薄膜横向结晶的特点和机理。研究了外加电场对金属诱导a-Si薄膜横向结晶的诸多影响因素,如场强及分布等。结果表明,相对于无电场时,适当强度的电场可显著加快金属诱导横向结晶的速率,场强超过某一临界值则降低该速率,并基于电迁移效应作了较好的解释。对Cu诱导a-Si薄膜横向结晶,在同样条件下,直交流混合电场比单纯的直流电场能引发更高的结晶速率。

金属诱导a-Si横向结晶速率与外电场的关系

分析了外加直流电场对Al和Ni诱导非晶硅(a-Si)薄膜横向结晶速率的影响,指出,在热处理条件下,Al和Ni能加快诱导a-Si薄膜横向结晶的速率;适当强度的外加电场能明显加快金属诱导a-Si横向结晶速率;Al和Ni诱导a-Si结晶速率的增大主要是电场提高了扩散物的迁移率。但场强超过某临界值后该速率降低。基于电迁移效应,对此结果作了较合理的解释。结合文献,提出一经验公式,并用MATLAB模拟了外电场中Al和Ni诱导a-Si薄膜横向结晶速率曲线。

抗艾滋病及肿瘤主药黄芪药材主、侧根中多糖含量的比较

目的:比较抗艾滋病及肿瘤主药黄芪药材主、侧根中多糖的含量。方法:以无水葡萄糖为标准品绘制标准曲线,运用紫外分光光度法选择波长488.7nm,对黄芪药材主、侧根中多糖含量进行测定。结果:黄芪药材主根中多糖含量比侧根平均高14.06%。结论:该研究对黄芪质量评价具有积极意义,提示临床应用黄芪应注意主根、侧根的差别。

单侧后牙深覆盖患者髁突侧方运动轨迹特征

目的探讨单侧后牙深覆盖患者下颌侧方运动时髁突轨迹的特征及和正常之间的差异。方法选择正常12例,单侧后牙深覆盖32例,应用髁突运动轨迹扫描ARCUS digmⅡ型记录髁突运动轨迹。采用spss10.0统计学软件分析比较两组之间是否存在统计学差异。结果实验组侧方运动中非深覆盖侧髁突矢状向及最大位移量显著大于对照组(P<0.05),水平位移小于对照组(P<0.05),非深覆盖侧髁突向后运动的幅度小于正常对照组(P<0.05)。结论单侧后牙深覆盖患者下颌侧方运动过程中髁突运动轨迹与正常有明显差异。

胶体金免疫层析法和乳胶凝集试验检测隐球菌荚膜多糖抗原对艾滋病继发隐球菌感染的诊断价值

目的探讨胶体金免疫层析法(LFA)和乳胶凝集试验(LA)检测隐球菌荚膜多糖抗原对艾滋病患者继发隐球菌感染的诊断价值及治疗观察的临床意义。方法采用LFA和LA对艾滋病患者继发隐球菌感染治疗前后的脑脊液标本和血清标本行隐球菌荚膜多糖抗原检测,并与脑脊液墨汁染色和真菌培养进行比较,评价其诊断的灵敏度和特异度。同时动态观察治疗期间隐球菌荚膜多糖抗原滴度的变化,和LFA的干扰因素。结果 LFA和LA对脑脊液标本隐球菌检测的敏感度分别为97.73%和95.45%,血清标本的敏感度也分别为97.73%、95.45%;对脑脊液标本的特异性分别为95.83%、95.83%,对血清标本的特异性分别为89.39%和87.12%。艾滋病继发隐球菌感染患者脑脊液标本中的隐球菌荚膜多糖抗原滴度随着患者病情的好转而逐渐下降,治疗前后脑脊液和血清中荚膜抗原滴度差异均有统计学意义(t=6.309,P<0.001;t=6.814,P<0.001)。结论 LFA与LA适用于隐球菌脑膜脑炎患者的快速诊断;脑脊液隐球菌多糖荚膜抗原的动态监测对艾滋病患者继发隐球菌感染的疗效观察具有重要的参考价值。

计算机模拟辅助定位器进行枢椎侧方椎弓螺钉定位

目的 通过计算机模拟实现枢椎侧方椎弓螺钉定位器与枢椎的三点对应关系 ,抛开对参照系的依赖。方法 以枢椎标本的薄层扫描图像为基础 ,利用Unigraphics软件的建模功能建立枢椎模拟实体 ,同时建立不同长度和粗细的模拟螺钉和可调式侧方椎弓定位器的各个组件 ,利用Unigraphics的装配功能将定位器组装起来。利用配对和定位方法寻找出侧方椎弓螺钉的安全钉道 ,并由此确定定位器和椎板对应点的距离关系及定位器后方角度指示器和内侧角度指示器组件的位置。结果 利用计算机模拟可以确定侧方椎弓螺钉的长度、粗细和钉道方向 ,同时可以使定位器与枢椎椎板特征点的位置一一对应起来 ,不再受参照系的影响。结论 利用计算机辅助确定定位器与枢椎标本的位置对应关系 ,可以使定位器的定位功能完全发挥出来 ,理论上可以不再需要术中透视进行位置校准。