Plant regeneration of protoplasts isolated from suspension cells derived from leaf blale of Oryza sative

We used the leaf blade of rice (cultivars were Nonghu 6, Sugeng 2, Huyou 2 and Hanfeng) as initial material for protoplast culture, and a great number of regenerated plants were obtained. Rice seeds were sterilized and germinated. The immature leaves were cut into 3-5 mm pieces when the third or forth leaf appeared. Leaf pieces were inoculated on MS medium with 2,4-D 4 mg/1, NAA 2mg/1 and IAA Img/1. After 2 wk culture, calli were induced and subcultured once or twice for multiplication. 3-5 g calli were transferred to the modified MS liquid medium with 2,4-D 2 mg/1 and KT 0.5mg/1 for suspension culture. Embryogenic cell suspension was established after 2 mo culture. The effect of the growth period of suspension cells on the

菠萝叶基原生质体分离与瞬时转化体系的建立

【目的】研究菠萝叶基原生质体的高效分离方法,并对制备的原生质体进行瞬时转化,为利用菠萝原生质体进行菠萝基因功能研究提供技术支持。【方法】以‘巴厘’菠萝(Ananas comosus,‘Comtede Paris’)幼嫩叶片的叶基为材料,采用3因素3水平正交试验L _(9)(3^(3))分析纤维素酶质量浓度(6,12,20 g/L)、离析酶质量浓度(3,6,9 g/L)和甘露醇浓度(0.4,0.5,0.6 mol/L)对分离原生质体产量与活力的影响;同时,利用单因素试验(设置酶解时间2,4,6 h)筛选制备原生质体的最适酶解时间,确定分离菠萝叶基原生质体的最适条件;在最适条件下制备原生质体,采用聚乙二醇(PEG)介导法转化质粒,建立菠萝原生质体瞬时转化体系。【结果】L 9(33)正交试验结果显示,不同处理分离的原生质体产量为1.01×10^(6)~1.93×10^(6)g^(-1),纤维素酶质量浓度是决定原生质体产量的关键因素;原生质体活力为65.55%~87.00%,甘露醇浓度对原生质体活力的贡献最大。最适酶解条件为:菠萝叶基在含12 g/L纤维素酶、6 g/L离析酶、0.6 mol/L甘露醇的酶液中避光酶解4 h,产量可达1.96×10^(6)g^(-1),活力为85.54%。菠萝叶基原生质体通过PEG介导法转化pAN580-WRKY75质粒后,可在激光共聚焦显微镜下观察到核内的绿色荧光信号。【结论】确定了菠萝叶基原生质体的最适分离条件与瞬时转化方法,建立了适用于菠萝基因功能分析的原生质体瞬时表达体系。

松叶猪毛菜叶片原生质体的制备及优化

从植物组织中释放出高质量的原生质体是建立其他技术体系如蛋白亚细胞定位、瞬时表达分析、蛋白质间互作的前提。为了快速挖掘C_(3)-C_(4)中间型植物松叶猪毛菜(Salsola laricifolia)的特殊功能基因,建立一个简单高效的叶片原生体的制备方法必不可少。本研究以松叶猪毛菜无菌组培苗的真叶为材料,分析不同纤维素酶和离析酶的浓度配比、渗透压对原生质体分离的影响。结果表明:采用25 d龄的无菌组培苗真叶,在2%纤维素酶+0.5%离析酶+0.6 mol·L^(-1)甘露醇的酶解液中25℃酶解2 h,使用W5溶液在800 rpm·min^(-1)的转速下纯化,原生质体产量可达1.21×10^(6)个,活力为85%。并且利用得到的松叶猪毛菜原生质体作为受体,用PEG转化法成功转化pBI121-SaNADP-ME4-GFP质粒载体,检测到SaNADP-ME4定位于叶绿体中。本项研究建立了松叶猪毛菜叶片原生质体高效制备体系,为松叶猪毛菜特殊基因功能的挖掘奠定了基础。

紫薇叶片原生质体的分离及瞬时转化

【目的】研究紫薇叶片原生质体的分离方法,并对制备的原生质体进行瞬时转化,为紫薇本源物种的基因功能分析提供技术支持。【方法】以F 1株系S047(以屋久岛紫薇(L.fauriei)为母本、紫薇品种‘Pocomoke’为父本杂交获得)及‘Ebony Embers’和‘Pocomoke’3个紫薇品种幼嫩叶片为材料,对其进行酶解,筛选最适紫薇品种,在此基础上,采用单因素试验初步筛选纤维素酶、离析酶质量浓度(5,10,15,20,25,30 g/L)及甘露醇浓度(0.4,0.6,0.8 mol/L),之后采用3因素3水平正交试验筛选纤维素酶(10,20,30 g/L)、离析酶(3,5,7 g/L)和果胶酶(2,4,6 g/L)的最适质量浓度,确定分离紫薇原生质体的最优条件。用聚乙二醇(PEG)介导法将质粒pSuper1300::GFP转化紫薇原生质体。【结果】分离原生质体的最适紫薇品种为S047株系,其在酶解过程中无褐化现象,分离液呈明亮绿色,可得到完整的原生质体;其他2个品种未分离到原生质体。单因素试验结果显示,最适的纤维素酶质量浓度为15~20 g/L,离析酶质量浓度为5~10 g/L,甘露醇浓度为0.6 mol/L。正交试验结果表明,10 g/L纤维素酶、5 g/L离析酶、4 g/L果胶酶和0.6 mol/L甘露醇混合液为最佳酶解溶液,在黑暗条件下酶解紫薇幼嫩叶片5 h,可成功分离出紫薇原生质体,其产量达28×10^(5)g^(-1),破损率为14%。将纯化的原生质体进行PEG介导的转化后,在激光共聚焦荧光显微镜下观察到绿色荧光信号,表明基因转化成功。【结论】获得了紫薇叶片原生质体分离体系,并成功进行了基因瞬时转化。

卡特兰叶片原生质体分离条件的研究

试验以卡特兰叶片组织为材料,研究了预处理时间、酶液组合、酶解时间、酶液中甘露醇含量等不同因素对其原生质体分离的影响.结果表明,以1%的纤维素酶+0.3%的果胶酶为混合酶液,11%的甘露醇为渗透压稳定剂,在25±1℃的条件下,pH为5.8的酶液组合中酶解8 h,获得的原生质体产量最高,可达8.9×106/g鲜重,存活率高达91.2%.

毛花猕猴桃原生质体再生植株

从毛花猕猴桃（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｅｒｉａｎｔｈａ Ｂｅｎｔｈ．）试管培养的实生苗新展开叶片分离的原生质体，培养在液体ＭＳ（除去ＮＨ４ＮＯ３）附加２，４－Ｄ １．０ ｍ ｇ／Ｌ和葡萄糖０．４ ｍ ｏｌ／Ｌ的培养基上。培养３周后植板率达到１９．４％ 。在未添加新鲜培养基的情况下，原生质体再生的细胞可持续分裂，并于３个月时长成２ ｍ ｍ 大小的愈伤组织。将该愈伤组织转移到附加玉米素０．５ ｍ ｇ／Ｌ和ＩＡＡ ０．１ ｍ ｇ／Ｌ的固体ＭＳ培养基上，分化出苗。试管苗经诱导生根。

柚类、橘类叶肉原生质体分离方法研究

原生质体是植物遗传改良的重要实验体系之一,而原生质体的分离是该体系的基础.对柑橘叶肉原生质体来说,柠檬、橙类等品种的叶肉原生质体比较容易分离,而柚类、橘类等柑橘品种则相对困难.本研究采用椪柑、黄岩本地早、沙田柚、冰糖橘4个品种为试材,枳壳试管苗为对照,系统研究了不同基因型、不同叶龄、不同酶种类、不同酶液组合对叶肉原生质体分离的影响,探讨了影响柚类、橘类等柑橘叶肉原生质体分离的因素,从中找出了各品种较适宜的分离条件.在适宜条件下,4种供试品种的原生质体得率(FW)可达10×106～20×106 g-1.

葡萄原生质体分离及瞬时转化体系的建立

为了建立葡萄原生质体进行遗传转化的技术,该研究以葡萄品种‘黑香蕉’的叶片和愈伤组织为材料,分析纤维素酶和离析酶的浓度与配比、渗透压和酶解时间等主要因素对葡萄原生质体分离的影响,探讨建立稳定、高效的葡萄原生质体分离与瞬时转化体系,为鉴定目标基因的功能奠定基础。结果表明:(1)葡萄叶片原生质体的分离以3.0%纤维素酶和0.75%离析酶的酶组合,在0.6mol/L甘露醇溶液中,酶解14h为宜,每克游离产量为4.09×106个原生质体,活力为83.12%。(2)葡萄愈伤组织原生质体的分离以2.0%纤维素酶和0.5%离析酶的酶组合,在0.5mol/L甘露醇溶液中,酶解14h为宜,每克游离产量为6.05×106个原生质体,活力为84.13%。(3)利用该方法得到的葡萄原生质体为受体,采用40%PEG-4000介导转化质粒载体pEZS-NL,目标基因瞬时表达产物检测表明,GFP蛋白表达稳定、清晰。该研究建立的葡萄原生质体制备和转化体系,可以用较少量的质粒DNA获得外源基因在原生质体内的表达,为葡萄功能基因的研究提供技术支持。

青天葵叶片原生质体分离条件的优化

以青天葵Nervilia fordii(Hance)Schltr.的新鲜叶片为试材,对青天葵原生质体的制备分离技术进行研究。用不同浓度的甘露醇溶液处理青天葵叶片下表皮细胞,进行细胞质壁分离试验,确定青天葵叶片细胞的等渗浓度;采用正交设计研究酶解法制备青天葵叶片原生质体的最适合纤维素酶浓度、离析酶浓度及酶解时间。结果表明,青天葵叶片细胞的等渗浓度为11%甘露醇;采用1.0%纤维素酶R-10+0.6%离析酶R-10的混合酶液酶解青天葵叶片12 h能达到很好的分离效果,获得高质量的原生质体。

药用植物青天葵叶片原生质体的制备与纯化

[目的]研究青天葵原生质体的制备与纯化方法。[方法]以青天葵新鲜叶片为试验材料,以青天葵叶片原生质体产量及原生质体存活率为考察指标,研究了预处理、酶解方式、酶解温度、离心转速、光照、筛网目数等因素对青天葵原生质体分离纯化效果的影响。[结果]适宜青天葵叶片原生质体游离的条件是用浓度13%甘露醇溶液预处理叶片1 h、酶解温度(25±1)℃、黑暗、静置;原生质体纯化采用离心沉淀法,以200目筛网过滤后离心8 min(800 r/min),操作2次,可得到大量完整清晰、细胞碎片少的原生质体。[结论]该方法获得了制备青天葵原生质体的理想条件与参数,为建立青天葵原生质体再生体系提供了依据。

罗勒(Ocimum basilieum)原生质体的分离和纯化

以罗勒愈伤组织、悬浮培养细胞、无菌苗幼叶为材料,研究了罗勒原生质体的分离纯化方法及影响因素。结果表明:材料的起始状态对原生质体分离的产量、质量均有明显影响;以泥状愈伤组织为材料,其原生质体的产量(以鲜重测)可达1.25×107个/g,存活率大于94%。该原生质体可进一步用于罗勒的原生质体培养与细胞融合。

玉米叶片原生质体的制备

本文以玉米黄化叶片为材料，采用两步酶解的方法研究了从玉米叶片制备原生质体的方法，发现第一次酶解以３０℃处理１ｈ为宜，第二次酶解以３０℃处理２．５～３ｈ较合适。同时发现所得原生质体净化悬浮时用２５％的蔗糖溶液在２５００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ能获得较好的净化效果。

矮牵牛叶肉原生质体分离条件的优化

以幼嫩叶片为试材,探讨了渗透压(甘露醇浓度)、水解酶浓度、酶解时间等关键因素对矮牵牛叶肉原生质体分离效果的影响。研究结果表明,以2%纤维素酶R-10+0.2%果胶酶Y-23+0.4%离析酶R-10+20 mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)+0.1%牛血清白蛋白(BSA)+0.11%无水氯化钙(CaCl_2)为酶解液,在0.5mol/L甘露醇浓度下静置酶解5h,1 100r/min离心2min沉淀原生质体,原生质体产量及活性分别为2.90×106个/g和88.1%,可为后续原生质体培养及融合提供材料。

菜豆叶肉原生质体培养

从菜豆无菌试管苗叶肉细胞游离获得原生质体.在悬浮培养基中原生质体分裂并形成细胞群。一月后将小愈伤组织转接至MS(含3 mgl^(-1)2,4—D和0.2mgl^(-1)6—BA)固体培养基上,扩增出大量由原生质体产生的愈伤组织.

番木瓜幼叶原生质体分离研究

【目的】探讨番木瓜幼叶原生质体的最佳分离条件。【方法】以20～30日龄番木瓜无菌苗幼叶为材料,对原生质体分离过程中酶液组合、酶解时间、纯化离心速度（500～1500rpm）及离心时间（6～10min）进行探讨。【结果】随着酶解液中纤维素酶和果胶酶含量的提高,番木瓜原生质体产量逐渐升高,而其活力逐渐降低,其中以为2.0%纤维素酶＋0.5%果胶酶组合的效果较好,解离时间以8h为宜。随着酶解液中甘露醇浓度的升高,原生质体的产量呈现先增加后降低的趋势,在0.55mol/L时达到最大（2.48×106个/gFW）。在悬浮纯化原生质体时,以1000rpm离心6～8min的效果较好。【结论】适宜原生质体分离的酶解液为2.0%纤维素酶＋0.5%果胶酶＋25mmol/LMES＋0.55mol/L甘露醇,最适酶解时间为8h;在原生质体纯化时,使用1000rpm离心6~8min,有利于获得产量及活力较高的原生质体。

植物叶片原生质体分离的可能机制(英文)

分析了植物叶片在分离液环境中形成原生质体的过程,文中提出,分离液配方中的酸性物质使植物叶片处于酸性环境中并导致植物正常细胞首先发生细胞壁酸性降解,随后出现原生质体脱离细胞壁进入分离液,继而又进一步发生质膜的酸性降解,使细胞核和细胞器进入分离液中,最终分离液中的细胞器以细胞核为中心进行细胞器重组,最后产生外貌形态一致的新的原生质体。植物细胞壁和质膜是植物细胞的包被系统。植物细胞包被系统的酸性降解使植物细胞器重组并产生新的原生质体成为可能。

橡胶树叶片原生质体分离条件的优化

分别以橡胶树GT1种子实生苗古铜期、变色期、淡绿期和稳定期4个不同发育阶段的叶片为材料进行原生质体的酶解分离研究,同时分析比较不同酶组合、酶解时间和甘露醇浓度等主要因素对橡胶树叶片原生质体产量和活力的影响,建立高效稳定的橡胶树叶片原生质体分离体系,为进行橡胶树外源基因瞬时表达及CRISPR基因编辑等研究快速提供高产优质的原生质体。结果表明:在同等条件下,变色期叶片的原生质体产量和活力最高,分别为14.8×10~7个/g FW和97.3%;其次为古铜期叶片,可达到8.6×10~7个/g FW和95.2%;淡绿期和稳定期叶片原生质体的产量非常低,活力也相对较低,分别仅有3.4×10~5个/g FW和89.5%、7.2×104个/g FW和80.6%。单因素实验结果表明,最适合变色期叶片原生质体分离的条件为:酶组合为2%纤维素酶+0.6%离析酶、酶解时间为6 h、甘露醇浓度为0.6 mol/L,此时橡胶树叶肉原生质体的产量可高达19.7×10~7个/g FW,活力约为97.6%。

红叶石楠叶片原生质体分离条件的研究

以红叶石楠(Photinia×frasery)叶片为试验材料,研究了预处理时间、酶类组合、酶解时间、酶液中甘露醇含量及酶解温度等不同因素对其原生质体分离的影响。结果表明,以1.0%的纤维素酶+0.3%的果胶酶为混合酶液,11%的甘露醇为渗透压稳定剂,在25℃±1℃的条件下,酶解8h,获得的原生质体产量最高,可达14.7×106个/g(FW),原生质体活力可达84.5%。

荔浦芋疫病病原鉴定及原生质体制备（英文）

【目的】鉴定荔浦芋疫病病原及制备原生质体,为荔浦芋病原检测、致病机理研究及健康种苗生产提供科学依据。【方法】对采集自广西荔浦县芋头种植区的芋疫病标样进行分离,通过形态特征和r DNA-ITS分子生物学相结合的方法对其病原进行鉴定,同时对获得的病原菌进行原生质体制备。【结果】通过对分离的芋疫病病原进行致病性测定、形态特征观察,将引起荔浦芋疫病的病原初步鉴定为芋疫霉菌(Phytophthora colocasiae);r DNA-ITS序列分析结果表明,菌株DNA序列与Gen Bank已发表的P.colocasiae不同分离物序列同源性达99%,进一步确定所测菌株为芋疫霉菌。制备获得的芋疫霉菌原生质体呈透明圆形或近圆形,大小不一。【结论】引起荔浦芋疫病的病原为芋疫霉菌,制备的芋疫霉菌原生质体可用于芋疫霉病致病机理研究。

大豆幼苗根和叶片原生质的分离与纯化

研究了大豆幼苗根和叶片原生质体的分离、纯化方法及其影响因素。结果表明:适宜大豆根和叶片原生质体分离的酶种类、浓度分别为CPW-13M{CPW(细胞清洗液)+13%(W/V)甘露醇}+3%纤维素酶(cellulose R-10)+1.1%果胶酶(macerozyme R-10)+1.0%半纤维素酶(hemicellulase)和0.15%CaCl2.2H2O+9%甘露醇+1%cellulase R-10+0.20%pectolase Y-23,pH5.8,酶解温度为28℃。在根酶解时间为16h时,原生质体产量可高达1.46×105个.g-1FW,活力达57.8%;叶片酶解时间为4h时,原生质体产量可高达1.74×106个.g-1FW,活力达70.3%。对于根而言,从产量和活力两方面考虑,其原生质体用23%蔗糖和CPW-18M混合后的下沉法纯化效果较好,而叶片用25%蔗糖的上浮法纯化效果较好。