马铃薯卷叶病毒PLRV RT-LAMP检测方法优化

马铃薯卷叶病毒Potato leafroll virus(PLRV)是目前严重影响马铃薯产量与品质的主要病毒之一,给马铃薯产业造成巨大损失。本研究采用环介导等温核酸扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术建立PLRV的RT-LAMP检测方法。采取单因素变化试验,对RT-LAMP反应体系中多个因素包括引物组合、温度条件及Mg2+、betaine、Bst 3.0 DNA聚合酶、dNTPs、UNG、SYBR GreenⅠ和引物组合的浓度进行一系列试验和优化。采用RT-PCR检测方法进行平行比对试验,对优化后的RT-LAMP反应体系进行了验证。结果表明,最佳引物组合为P3,最适反应温度62℃,25μL反应体系中,Mg2+、betaine、Bst 3.0 DNA聚合酶和UNG的最佳终浓度分别为4 mmol/L、0 mmol/L、0.64 U/μL和0.08 U/μL,dNTPs的最佳用量为1μL(dATP、dGTP、dCTP各0.4 mmol/L,dUTP 1.2 mmol/L),SYBR GreenⅠ(20×)的最佳用量1μL,primer mix的最佳用量2.5μL(PLRV-FIP/BIP、PLRV-F3/B3和PLRV-LF/LB的浓度分别为0.8、0.2μmol/L和0.6μmol/L),RNA模板1μL(2 ng/μL),加DEPC-H2O至25μL,反应时间50 min。优化后的RT-LAMP检测结果与RT-PCR一致,且可视化判读结果。因此,建立的PLRV RT-LAMP检测方法为进一步开发RT-LAMP检测试剂盒及其实际应用奠定了基础。

抗卷叶病毒（PLRV）转基因马铃薯栽培种及其抗病性研究

应用本室合成、克隆的马铃薯卷叶病毒（Ｐｏｔａｔｏｌｅａｆｒｏｌｌｖｉｒｕｓ，ＰＬＲＶ）中国分离株的外壳蛋白（ＣＰ）基因，通过致瘤农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）介导，以马铃薯叶园片为转化材料，转化了马铃薯Ｄｅｓｉｒｅｅ、Ｆａｖｏｒｉｔａ、虎头和乌盟６０１，并获得了上述四个栽培种的转基因植株，成功地建立了一种简单、快速和效率高的转化体系，卡那霉素抗性、ＰＣＲ扩增目的基因、Ｓｏｕｔｈｅｍ和Ｎｏｒｔｈｅｍｂｌｏｔ分析证明，ＰＬＲＶ外壳蛋白基因已经稳定整合进入转基因马铃薯的染色体组中，并在转录水平上得到表达。窄缝转移分析（Ｓｌｏｔｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓ）表明，每个转化体四倍体基因组中含有１－５个ＣＰ基因拷贝。转基因植物的接种试验证明，转基因工程植株中的ＰＬＲＶ滴度比未转基因的对照植株显著低。蚜虫传播试验证明，转基因植株可减少蚜虫在田间传播ＰＬＲＶ的效率，限制了ＰＬＲＶ的传播，减少田间植物发病的机会。

PLRV 56KD蛋白基因植物转化载体的构建

为培育转基因抗马铃薯卷叶病毒的新材料 ,采用二次连接法将存在于克隆载体 p L R5 6中的马铃薯卷叶病毒 5 6 KD蛋白基因及 3 端非编码区构建到双元载体系统的中间表达载体质粒p ROK 中 ,采用三亲融合法和直接导入法转化根癌农杆菌 LBA4 40 4 ,PCR法检测。实验表明 ,二次连接法效果优于一次连接法 ,两种连接法对比 ,二次连接法更适用于大分子质粒的重组。直接导入法比三亲融合法更简便 ,二者转化效率没有显著差异。实验构建完成马铃薯卷叶病毒 5 6 KD蛋白基因及 3 端非编码植物转化载体 ,建立了高效。

马铃薯卷叶病毒中国株(PLRV-Ch)复制酶基因结构研究

用设计合成的两对特异性引物 ,以马铃薯卷叶病毒中国分离株PLRV ChRNA为模板 ,经反转录PCR扩增 ,将复制酶基因 3′端 0 .6kb和 5′端 1.2kb ,克隆于 pUC19中 ,分别构建了重组质粒pLR3和 pLR5,并分五段进行了序列分析。将获得的核苷酸序列及氨基酸序列与国外报导的四个PLRV分离株的相应区段的序列同源性进行了比较。结果表明具有高度同源性。文中对核苷酸序列中存在的可能移码序列和其下游的茎环结构或假节结构、以及特征性三次重复区及氨基酸序列中复制酶蛋白N端的碱性氨基酸序列以及C端区域中包括GDD在内的 8个特征序列进行了讨论。作者发现移码序列上游的三次重复的核苷酸序列可以形成连续折叠的互补双链区和发夹结构 ,这一结构可能和转译移码有关。此外PLRV复制酶蛋白N端部分氨基酸序列易变 ,而C端氨基酸序列十分保守 ,可能和复制酶功能有更重要关系。

二价核酶基因构建及对PLRV负链靶序列的体外切割研究

根据锤头状核酶的作用模式,设计、合成并克隆了特异性切割马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV)中国分离株(PLRV-Ch)复制酶基因负链RNA的二价核酶序列。将该核酶基因克隆到pGEM-4Z中,构建成体外转录载体pGEM-4ZDR;同时将包含核酶切割识别位点的PLRV-Ch复制酶基因cDNA近5'端的874 bp片段反向插入到pGEM-4Z中,构建了体外转录载体pGEM-4ZR5。以线性化的重组质粒pGEM-4ZDR和pGEM-4ZR5为模板,在T7 RNA聚合酶的作用下,分别转录获得核酶RNA和PLRV-Ch复制酶基因5'端负链RNA底物片段。将以上2种RNA转录物混合并经37℃保温后,检测结果表明,所得核酶RNA对PLRV-Ch复制酶基因负链RNA在体外具有较强的特异切割活性。

牡丹病毒病研究进展

笔者纠正了“3种牡丹(芍药)病毒”的过时观点,统计、分析了国际上共计17种病毒侵染牡丹、芍药的情况,回顾了国内学者对牡丹、芍药病毒病的研究成果,包括对烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)侵染、为害牡丹、芍药的调查,近年来新发现的牡丹卷叶相关病毒(peony leafroll-associated virus,PLRaV)等多种侵染牡丹、芍药的新病毒,苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)等已知病毒侵染牡丹、芍药的寄主新纪录,利用VIGS(virus induced gene silencing)技术研究牡丹、芍药基因功能等一系列研究。目前国内牡丹病毒病基础研究仍然存在多方面不足,如国家级课题专项资助机会少,对传统牡丹、芍药栽培中心病毒病发生本底情况不明,对病毒侵染、传播机制研究不深入等;在病毒病检测与诊断技术应用方面与西方国家相比存在明显的劣势,如基层的技术人员对病害诊断知识更新不及时,对病毒病的分子检测技术的最新发展了解不全面。由此提出应用分子检测技术开展全国范围的牡丹病毒病普查、开始牡丹病毒病的危险性分析和风险管理等有益建议。

马铃薯卷叶病毒中国株(PLRV-Ch)ORF2a基因5′端的克隆和序列分析

用设计合成的一对特异性引物,以马铃薯卷叶病毒中国株PLRV-Ch的RNA为模板,经反转录PCR扩增,将获得ORF2a的5′端0.6kbcDNA克隆于pUC19中,构建成重组质粒pLR8.PCR检测和酶切检测表明,获得了ORF2a的5′端0.6kbcDNA克隆,从该cDNA两端进行了两次序列分析,并将获得的核苷酸序列与国外报道的4个PLRV分离株的相应区域的同源性进行了比较,5个序列间具高度同源性.

用复制酶基因cDNA探针检测表达病毒外壳蛋白基因马铃薯中的PLRV

利用马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）复制酶基因３′端长约６００ｂｐ的ｃＤＮＡ，用缺口平移方法进行３２Ｐ同位素标记，制备成ｃＤＮＡ探针，通过核酸斑点杂交，对提纯的马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）、病毒ＲＮＡ、ＰＬＲＶ感染的马铃薯汁液，表达ＰＬＲＶＣＰ基因的马铃薯叶片及块茎芽进行了检测．结果表明，３２Ｐ标记的复制酶基因ｃＤＮＡ探针特异性强、灵敏度高．可测得提纯病毒的最低含量为４０８ｎｇ／ｍｌ，病毒ＲＮＡ最低量为２７．８ｐｇ／ｍｌ，未转ＣＰ基因接种ＰＬＲＶ的马铃薯叶片提取液的最高稀释度为１３７５．接种ＰＬＲＶ的转ＣＰ基因的抗性马铃薯块茎芽和叶片提取液的最高稀释度为０～１／１５．此探针和只转入病毒外壳蛋白基因，不接种ＰＬＲＶ的转基因马铃薯汁液不发生反应．表明，探针只与ＰＬＲＶ基因组ＲＮＡ特异反应，而不与外壳蛋白基因及其ｍＲＮＡ反应，从而为表达ＣＰ基因的转基因马铃薯中ＰＬＲＶ的检测和抗病性鉴定建立了一种可靠的灵敏的分子生物学技术．此项技术已用于转ＣＰ基因马铃薯Ｄｅｓｉｒｅ，Ｆａｖｏｒｉｔａ。

葡萄卷叶伴随病毒-3 RT-LAMP检测体系的建立与应用

为实现葡萄生产中对葡萄卷叶伴随病毒-3(GLRaV-3)的快速检测。本研究以GLRaV-3的CP基因序列(GenBank登录号:KC477128.1)为靶序列设计并合成了3对逆转录环介导恒温扩增技术(RTLAMP)引物,建立并优化GLRaV-3的RT-LAMP检测方法。结果表明,该方法能够实现在恒温64℃下反应1 h完成对GLRaV-3的检测,引物GLRaV3-LAMP-Ⅰ特异性高,不与GLRaV-1~2、葡萄扇叶病毒、沙地葡萄茎痘相关病毒、葡萄病毒A、灰皮诺葡萄病毒和葡萄浆果内坏死病毒等7种葡萄常见病毒发生交叉反应;RNA最低检测限为10 pg·μL^(-1),灵敏度是逆转录PCR(RT-PCR)的10倍。田间样品检测验证结果表明,该方法与常规RT-PCR法检测一致率为100%。综上,本研究建立的GLRaV-3 RT-LAMP检测体系具有高特异性、高灵敏度和实用性强等特点,可应用于田间葡萄卷叶病样的检测。

应用RT-PCR法快速检测马铃薯卷叶病毒

根据马铃薯卷叶病毒的外壳蛋白基因序列 ,设计合成了一对寡核苷酸引物 ,从感染PLRV的马铃薯病叶组织中提取出病毒的RNA ,进行cDNA合成及PCR扩增 ,得到一条长度约 6 2 0bp的特异PCR扩增产物 ,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致。建立了快速灵敏简便的PLRV检测的新方法 ,其灵敏度要比PLRV的血清学检测方法高 10 4倍 ,在基因水平上为PLRV的检测提供了更新手段 。

马铃薯卷叶病毒云南分离物外壳蛋白基因的克隆与序列分析

With designed specific primers based on Potato leafroll virus(PLRV) coat protein(CP) gene sequence,one PCR fragment(about 0.6 kb) was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) using the total RNA as template extracted from virus infected potato plant collected in Zhaotong,Yunnan province.The fragment was cloned into pGEM-T easy vector and sequenced.The sequence was compared with that of homologous gene of other PLRV isolates.The results showed it had high homology with the other isolates(the highest homology reached 99.2% of nucleic acid).Based on CP amino acid sequence the phylogenic tree of PLRV was established and the isolates were clustered into many groups.

马铃薯卷叶病毒分离株外壳蛋白基因和17k蛋白基因的克隆及序列分析

从典型的马铃薯卷叶病毒病株中直接提取出植物总RNA ,根据PLRV外壳蛋白基因序列 ,设计合成了一对寡核苷酸引物 ,经RT -PCR法扩增出全长的cDNA片段 ,将其克隆到质粒pGEM - 3Zf (+)上 ,并进行了序列分析。结果表明 ,克隆的cDNA片段由 6 2 7个核苷酸组成 ,编码 2 0 8个氨基酸组成的理论分子量为2 3k的蛋白 ,与PLRV外壳蛋白的大小一致 ;此外克隆片段还含有一个不同于外壳蛋白基因的阅读框架 ,该框架由 46 5个核苷酸组成 ,编码 15 5个氨基酸组成的理论分子量为 17k的蛋白 ,与PLRV的 17k蛋白大小一致。与国外报道的几个株系相比 ,PLRV分离物的外壳蛋白基因及 17k蛋白基因的核苷酸同源率分别高达97 5 %～ 99 7%和 96 5 %～ 99 6 % ,由此推测的氨基酸同源率高达 97 6 %～ 99 5 %和 96 1%～ 99 4% ,说明所克隆的PLRV外壳蛋白基因和 17k蛋白基因具有高度的保守性 ,本研究克隆了PLRV分离物外壳蛋白和17k蛋白基因的序列 。

重组CP多克隆抗体在马铃薯卷叶病毒DAS-ELISA检测中的应用

先经过饱和硫酸铵沉淀分离,再用Protein G亲和层析柱纯化,从马铃薯卷叶病毒(PLRV)重组CP作抗原制备的抗血清中获得了高纯度多克隆抗体(IgG),并用戊二醛法一步法进行碱性磷酸酶的标记获得了酶标抗体(IgG-AP)。将纯化的抗体与酶标抗体用于感染PLRV病叶的检测,DAS-ELISA反应呈阳性,结果表明,用重组CP制备的多克隆抗体可成功地用于PLRV的DAS-ELISA检测。本研究为PLRV重组CP多克隆抗体的大量制备及ELISA检测奠定了基础。

怀山药病毒病的研究

目的 探明怀山药病毒病的症状和感染病毒的种类 ,为脱除怀山药病毒、提高产量、改善品质奠定基础。方法 调查怀山药大田感病情况 ,应用电镜法观察病毒的大小和形状 ,采用分子生物学方法进一步探明病毒种类。结果 怀山药感染病毒后的症状为叶色失绿、花叶、畸形 ;在透射电镜下 ,观察到长 6 0 0～ 12 0 0 nm的线状病毒 ,并初步判断为马铃薯 Y病毒 ;PCR扩增后的电泳检测显示出了清晰的马铃薯 Y病毒和马铃薯卷叶病毒的电泳条带。结论 首次发现怀山药感染的病毒为马铃薯 Y病毒和马铃薯卷叶病毒 ,它是造成怀山药产量下降和品质退化的主要原因。

马铃薯卷叶病毒基因间隔区转化的马铃薯抗病性研究

将本室合成、克隆的马铃薯卷叶病毒（ＰｏｔａｔｏＬｅａｆｒｏｌＶｉｒｕｓ，ＰＬＲＶ）中国分离株的基因间隔区（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＩＳ）双链ｃＤＮＡ以正、反向两种方式分别构建于转化载体ｐＲＯＫ２中，通过致瘤农杆菌介导，以马铃薯叶圆片为转化材料，转化马铃薯栽培品种Ｄｅｓｉｒｅ，获得了转基因植株。卡那霉素抗性分析和ＰＣＲ检测目的基因，证明ＰＬＲＶＩＳ双链ｃＤＮＡ已经整合到转基因马铃薯的染色体基因组中。将转基因植株移栽网棚用蚜虫接种ＰＬＲＶ，观察症状并用酶联免疫吸附测定（ＥＬＩＳＡ）检测转基因植株中ＰＬＲＶ含量。结果表明，表达ＰＬＲＶＩＳ正意和反意ＲＮＡ的转基因植株，接种病毒后表现无症状或症状轻微，ＰＬＲＶ平均滴度均较未转基因对照植株低。表达正意ＲＮＡ的转基因植株ＰＬＲＶ滴度降低４３％～７２％，表达反意ＲＮＡ的转基因植株ＰＬＲＶ滴度降低７２％～８６％，由此可见，表达ＰＬＲＶＩＳ反意ＲＮＡ的转基因马铃薯对ＰＬＲＶ抗性较强。

基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的葡萄卷叶伴随病毒3号检测方法

【目的】建立一种快速、灵敏的重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测葡萄卷叶伴随病毒3(Grapevine leafroll-associated virus 3,GLRaV-3)方法。【方法】根据GLRaV-3已测序和已报道的HSP70基因(Heat shock protein 70)保守序列,设计用于RPA检测的特异性引物,建立GLRaV-3的RPA检测方法,并对其特异性和灵敏度进行验证。【结果】建立RPA检测方法能够从GLRaV-3带毒株中检测到约380 bp的特异性条带,仅需在37℃下恒温反应40 min,无需特殊的仪器设备,经特异性评价特异性好,且该方法与普通PCR检测灵敏度基本一致。【结论】建立的RPA检测方法特异性强、灵敏度高,无需特殊的仪器设备,适合GLRaV-3的快速检测方法。

三种葡萄病毒的RT-PCR检测和系统进化分析

【目的】为了研究不同葡萄病毒病快速检测方法和四川分离株系统进化,【方法】比较3种葡萄总RNA提取方法,还优化了葡萄病毒病的RT-PCR检测方法。分别克隆了3种病毒四川分离株的部分基因组区域,并开展了系统进化分析。【结果】结果表明,改进硅胶颗粒吸附法快速从葡萄枝条的韧皮组织中提取了总RNA,并以葡萄18SRNA为内参基因,RT-PCR分别成功扩增出3种病毒的目的片段。把16个地理起源的GLRaV-2分离株的外壳蛋白基因(Coat protein,CP)分成5个系统进化组。而7个地理起源的GVB分离株CP同源性为79.1%～98.7%。此外,5个GVA四川分离株分别位于系统进化树的4个聚类群。【结论】GLRaV-2、GVB和GVA不同地理起源的分离株在核酸水平上具有变异性,其中GVA四川分离株之间具有显著的遗传差异,可能包括4种株系。

马铃薯卷叶病毒的RT-PCR快速检测

根据马铃薯卷叶病毒的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物。从感染马铃薯卷叶病毒(PLRV)的马铃薯叶片中提取出病毒RNA,进行cDNA合成并运用RT-PCR技术进行体外扩增,得到一条长度约627bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致,而对照未得到任何产物。从而建立了快速灵敏的PLRV检测方法,为PLRV的防治及检测提供了有效手段。

葡萄卷叶病毒Ⅲ RT-PCR检测技术研究

利用ＲＴ－ＰＣＲ技术,对葡萄卷叶病毒株系Ⅲ进行了检测。采用的技术流程为:通过提取葡萄叶片或韧皮部总ＲＮＡ,获得病毒的ＲＮＡ,反转录合成ｃＤＮＡ,经ＰＣＲ扩增,获得病毒ｃＤＮＡ的特征片段,并进行了序列分析。对提取的总ＲＮＡ进行了完整性和纯度检测,确定了良好的ＲＮＡ获得方法。结果表明,通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增的片段序列与病毒源序列的同源性高达９９．３%,说明采用本研究确定的方法检测葡萄卷叶病毒株系Ⅲ结果可靠。

马铃薯病毒一步法RT-PCR诊断研究

运用一步法RT-PCR对马铃薯和烟草中的马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒和马铃薯卷叶病毒进行了检测,实验表明:对酚-SDS方法提取的病毒核酸进行扩增,一步法RT-PCR检测到的扩增产物的灵敏度较两步法RT-PCR的高100倍左右.两种提取方法对比,用一步法RT-PCR进行扩增,检测到的PEG法扩增产物的灵敏度较酚-SDS法扩增产物的灵敏度高3倍.建立了快速、简便、灵敏度高、特异性强的马铃薯病毒一步法RT-PCR检测技术.