Anti-Tubercular Activities and Molecular Characterization of Salivary Extract of Leech (<i>Hirudo medicinalis</i>) against <i>Mycobacterium tuberculosis</i>

Leech salivary extract (LSE) was screened for the anti-tubercular activity against Mycobacterium tuberculosis using microbroth dilution method. The bioactive components in LSE were determined using Shimadzu GC-MS QP2010 SE. The LSE exhibited bactericidal effects on M. tuberculosis at 50% (v/v). The result of the GC-MS analysis of LSE revealed seventeen (17) bioactive components. The major fatty acid components were oleic acid (33.9%) and palmitic acid also known as hexadecanoic acid (22.6%). Other bioactive components detected in appreciable amounts in LSE include, 4-bromobutyric acid (16.86%), 6,17-Octadiene-1-ol acetate (9.78%) and octahydro-1,4,9,9- tetramethyl (5.21%). The anti-tubercular activity of the LSE was attributed to these bioactive components. The results obtained suggest that leech salivary extract could be used in treating tuberculosis.

水蛭乙醇提取物体外抗凝血活性研究

目的:研究水蛭不同提取物对人血浆的抗凝活性及作用环节。方法:测定水蛭乙醇提取物不同萃取部位对凝血酶原时间(PT),凝血酶时间(TT),活化的部分凝血活酶时间(APTT),纤维蛋白原凝固时间(FCT)的影响。结果:水蛭的乙酸乙酯部位显著地延长人PT,APTT,TT和FCT;石油醚部位、正丁醇部位、水部位也有较弱抗凝活性。结论:水蛭乙酸乙酯提取部分抗凝作用最强,直接抑制凝血酶催化的纤维蛋白原凝固。

水蛭水煎液抗栓作用机制的体外实验研究

目的研究水蛭提取液的抗凝和纤溶作用。方法观察水蛭水煎液及其醇溶和非醇溶部分抑制凝血酶引起纤维蛋白 (Fb)凝块形成的活性 ,纤维蛋白平板和SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析各提取液水解Fb和纤维蛋白原 (Fbg)的作用。结果水煎液及其醇溶部分可抑制Fb凝块形成 ,非醇溶部分无此作用。水煎液及其非醇溶部分可水解Fbg和Fb ,且以α链为主 ,对β和 链及牛血清白蛋白的水解作用弱 ;醇溶部分对这些蛋白的水解作用不明显。结论水蛭水煎液的醇溶和非醇溶部分分别含抗凝和纤溶物质 。

水蛭不同提取物抗凝活性的体外实验研究

目的 :研究水蛭不同提取物的抗凝活性 ,为水蛭的新药开发提供实验依据。方法 :Wistar大鼠腹静脉取血 ,应用血凝仪体外测定凝血酶原时间 (PT)、凝血酶时间 (TT)和活化的部分凝血活酶时间 (APTT)。结果 :水蛭的乙酸乙酯部分能使大鼠的PT、TT、APTT显著延长。正己烷部分、水溶液部分能使大鼠的PT显著延长 ,正丁醇部分能使大鼠的APTT显著延长。结论 :水蛭各提取物均有抗凝活性 ,水蛭中存在不同于水蛭素的新的抗凝血成分.

水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞体外抑制作用研究

目的研究水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞的体外抑制作用。方法以液氮快速冻融法制备水蛭提取物,以常规水提醇沉法水蛭提取物作对照,不同浓度体外干预人肝癌HepG2细胞,MTT法检测两种水蛭提取物对HepG2细胞增殖的抑制作用,并进行细胞计数,吖啶橙荧光染色法检测细胞凋亡情况。结果水蛭液氮快速冻融法提取物药物浓度为6～15mg/mL时,对人肝癌HepG2细胞的增殖有明显抑制作用,细胞数目明显下降,并呈剂量依赖性,与水提醇沉法提取物比较,差异有统计学意义(P<0.01)。吖啶橙染色可见典型的凋亡细胞形态学特征。结论水蛭液氮快速冻融法提取物可体外抑制HepG2细胞的增殖并诱导凋亡,其作用明显优于水蛭水提醇沉法提取物。

水蛭免加热提取物抗凝血作用及其机制研究

目的 :观察水蛭免加热提取物对动物凝血系统、凝血因子活性及纤溶系统的影响 ,并与水蛭煎煮浓缩物进行比较。方法 :动物灌胃给药 ,凝固法测大鼠 PT、APTT,PT法测血浆凝血因子 、 、 、 的活性 ,APTT法测因子 的活性 ,测 EL T观察药物对家兔纤溶活性的影响。结果 :水蛭免加热提取物能延长大鼠 PT、APTT,抑制凝血因子 、 、 的活性 ,对凝血因子 和 活性无明显影响 ;对兔血 EL T无明显影响 ,在延长大鼠 PT、降低大鼠凝血因子 、 活性等方面优于传统的煎煮提取物。结论 :水蛭免加热提取物通过抑制凝血因子 、 、 活性而抑制内、外源性凝血途径 ,对大鼠 PT、凝血因子 、

水蛭提取物对体外培养大鼠大脑皮层神经细胞缺氧性凋亡的影响

目的研究水蛭提取物对体外缺氧性新生大鼠大脑皮层神经细胞凋亡的作用。方法采用NSE染色法,观察体外培养大脑皮层神经细胞的含量,TUNEL法检测神经细胞的凋亡率,Hochest 33342荧光染色法观察其对缺氧性神经细胞凋亡的保护作用,Bcl-2及Bax凋亡蛋白染色法对抗凋亡的可能机理进行研究。结果新生大鼠大脑皮层神经细胞原代培养NSE染色的结果显示其神经细胞含量为93.28%±1.18%;水蛭提取物给药组神经细胞凋亡率明显低于凋亡模型组;荧光染色除水蛭提取物组250μg.ml-1组外,各组神经细胞凋亡率明显降低;药物干预组表达Bcl-2的神经细胞较凋亡诱导模型组显著(P<0.01);水蛭提取物组中表达Bax的神经细胞较凋亡模型组略少,其1、2 mg.ml-1组与模型组有显著性差异。结论水蛭提取物具有明显的抗脑神经细胞凋亡的作用,抗凋亡机理与其对Bcl-2及Bax蛋白的调控有关。

水蛭提取物对血管内皮细胞VEGF受体-2表达的影响

目的:研究水蛭提取物对凝血酶诱导的RF-6A细胞(恒河猴视网膜脉络膜血管内皮细胞)跨膜受体VEGFR2表达的影响,从而探讨中药水蛭用于防治新生血管形成中的作用。方法:将培养细胞分成水蛭组,凝血酶组,凝血酶+水蛭组及空白组。在前期实验基础上选择64g/L水蛭提取液及20NIHU/mL凝血酶。8h后,采用免疫组织化的方法检测各组细胞VEGFR2的表达,并进行图像分析。结果:免疫组化分析:与空白组比较水蛭组RF-6A细胞膜上VEGFR2的表达明显降低,降低程度高于凝血酶组,小于混合组,Sig=0.000,P<0.01各组间的差异有统计学意义。结论:水蛭提取物可使内皮细胞跨膜受体VEGFR2表达明显减少,推测其对VEGF受体介导的跨膜信号传导途径的作用可能是通过竞争性地抑制VEGF与其受体的结合。

水蛭免加热提取物对高凝动物模型凝血系统及血小板聚集率的影响

目的:观察水蛭免加热提取物对鞣花酸所致高凝动物模型凝血系统及血小板聚集率的影响。方法:动物灌胃给药,小鼠尾静脉注射鞣花酸制造高凝动物模型,以剪尾法测定出血时间(BT);眼球采血,玻片法测定凝血时间(CT)。大鼠舌下静脉注射鞣花酸,腹主动脉采血,用试剂盒测定凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT),PT法测定凝血因子Ⅱ的活性,按吴氏法测定循环血小板聚集率。结果:水蛭免加热提取物能延长高凝模型小鼠的BT、CT和高凝模型大鼠的PT、APTT,抑制凝血因子Ⅱ的活性,降低血小板聚集率。结论:水蛭免加热提取物对高凝模型动物具有抗凝血、抗血小板聚集作用。

水蛭提取物抗新生大鼠大脑皮层神经细胞凋亡的研究

目的:研究水蛭提取物对体外缺氧性新生大鼠大脑皮层神经细胞凋亡的保护作用。方法:实验设正常对照组、模型组、药物组及阳性对照组,采用MTT法观察水蛭提取物对神经细胞缺氧性坏死的影响,HE染色及Ho-chest 33342荧光染色法观察其对缺氧性神经细胞凋亡的保护作用。结果:水蛭提取物在500μg/mL^2 mg/mL浓度范围有抗神经细胞缺氧性坏死作用,使神经细胞坏死亡率明显下降,与凋亡模型组比较具有显著性差异(P<0.05);HE染色结果显示,水蛭提取物可明显减轻缺氧引起的神经细胞凋亡的形态学改变;Hochest 33342荧光染色除水蛭提取物组250μg/mL组外,各组神经细胞凋亡率明显降低,与模型组相比较差异有显著性(P<0.01)。结论:水蛭提取物具有明显保护脑神经细胞的作用。

几种水蛭抗凝血物质提取及活性分析

研究3种提取方法对菲牛蛭不同处理品的抗凝作用,采用筛选的最佳提取方法分析了5种水蛭各处理品的抗凝血酶活性,并比较了3个不同地理分布野生菲牛蛭和2个不同饵料饲喂菲牛蛭各处理品的抗凝血酶活性。结果表明:丙酮浸提法在菲牛蛭各处理品中均具有最高的提取得率,所测抗凝血酶活性显著高于其他方法(P<0.05);5种水蛭抗凝血酶活性测定结果显示非吸血蛭类的湿体匀浆液和干体无或微弱的抗凝活性,而吸血蛭类(日本医蛭和菲牛蛭)具有较高抗凝活性,且菲牛蛭的抗凝活性显著高于日本医蛭(P<0.01);不同地理分布野生菲牛蛭和不同饵料饲养菲牛蛭的湿体匀浆液、干体粉末和唾液腺分泌物抗凝活性均无显著差异(P>0.05)。研究表明菲牛蛭具有较强的体外抗凝血酶活性,且人工养殖对菲牛蛭的抗凝活性未产生不利影响。

水蛭提取液对视网膜色素上皮细胞内游离钙离子的影响

目的观察水蛭提取液对视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)内游离钙离子(Intracellular liber calcium ion,[Ca2+]i)浓度的影响。方法利用体外培养的视网膜色素上皮细胞,采用双波长荧光分光光度计测量法测定视网膜色素上皮细胞内[Ca2+]i浓度。结果空白组(A)133.4517±13.17789、凝血酶组(A1)192.2037±4.54292、水蛭组(A2)96.9935±8.80148、水蛭和凝血酶同时加组(A3)142.0867±26.47195、先加水蛭后加凝血酶组(A4)162.7284±29.13950、先加凝血酶后加水蛭组(A5)130.4810±20.48673。结论水蛭提取液能使RPE细胞内游离Ca2+浓度下降,为进一步深入研究水蛭提取液抑制RPE细胞增殖的作用机制,防治增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreo-retinopathy,PVR)提供了实验室依据。

炮制对水蛭性状及成分溶出的影响

对水蛭生品、传统烫制品及新法制品进行了物理性状、溶出效果、蛋白质、氨基酸的定性、定量分析。

水蛭提取液对恒河猴视网膜血管内皮细胞增殖和细胞周期的影响

目的观察渗滤法水蛭提取液对恒河猴视网膜血管内皮细胞RF/6A细胞增殖和细胞周期的影响。方法采用MTT法观察不同浓度水蛭提取液(0g.L-1、8g.L-1、16g.L-1、32g.L-1、64g.L-1、128g.L-1)对RF/6A细胞增殖的影响,筛选最佳抑制浓度,应用流式细胞仪观察水蛭提取液对凝血酶诱导的RF/6A细胞周期的影响。结果8g.L-1、16g.L-1浓度组水蛭提取液对血管内皮细胞RF/6A有促进生长作用,与空白对照组相比差异均有统计学意义(均为P<0.05);32g.L-1、64g.L-1、128g.L-1浓度组水蛭提取液对血管内皮细胞RF/6A均有明显抑制作用,与空白对照组相比差异也均有统计学意义(均为P<0.05);24hIC50为97g.L-1;64g.L-1为水蛭提取液的最佳抑制浓度,用于后期实验。流式细胞仪检测发现:水蛭提取液组G1期细胞比例(91.95±1.69)%高于其他各组,合药组(83.60±1.88)%高于凝血酶组(77.78±3.22)%,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。凝血酶组S期细胞比例(21.75±2.94)%高于其他各组,水蛭提取液组(7.55±2.45)%低于合药组(14.42±1.48)%,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论不同浓度的水蛭提取液对视网膜血管内皮细胞RF/6A的增殖产生不同作用,64g.L-1水蛭提取液可以抑制血管内皮细胞的增殖,将细胞阻滞在G1期,可能是一种潜在的抗新生血管药物。

水蛭提取液对大鼠上皮组织炎症的效果观察

目的研究水蛭提取液对实验性上皮组织炎症具有抗炎作用。方法对30只昆明小白鼠进行全层皮肤缺损处理,利用金黄色葡萄球菌建立皮肤炎症模型,以涂抹水蛭提取液为A组,涂抹红霉素为B组、涂抹凡士林为C组,分别记录相应药物涂抹前后的红肿的高度、面积,结痂的面积数值,将数值进行对比与统计学分析。结果水蛭提取液A组在红肿高度平均下降0.32mm,面积平均减小5.73 mm消炎程度方面与红霉素B组相比抗炎能相仿;A组与凡士林C组相互比较,A组抗炎效果明显(P<0.05),具有显著性差异。结论水蛭提取液对大鼠实验性上皮组织炎症具有抗炎作用。

肾康微丸中水蛭提取工艺的研究

目的:对肾康微丸中水蛭的提取工艺进行考察。方法:以水蛭醇提物的抗凝血活性为主要指标,醇溶性浸出物得率为辅助指标,首先考察了水蛭乙醇提取的温度;并采用正交实验对水蛭的乙醇提取条件进行了研究;亦确定了提取次数。结果:影响提取效果的因素顺序为:乙醇浓度>提取时间>乙醇用量,乙醇浓度对提取有显著性影响。结论:确定乙醇提取水蛭的最佳工艺为,加6倍量60%乙醇,60℃提取2次,每次1 h。

四种蛭体内抗凝血活性物含量的比较研究初探

根据匈牙利BagdyD．利用水溶性介质从蛭体内提取水蛭素的方法，初步研究比较了广泛分布于我省境内4种蛭体内抗凝血活性物含量的差异，确定了我省可用于抗凝血活性物提取的蛭类。

水蛭渗滤液对猴RF/6A细胞表达TNF-α的影响

目的观察水蛭渗滤液对凝血酶诱导下猴脉络膜-视网膜(内皮)细胞(RF/6A)表达促血管生成因子TNF-α的影响。方法采用消化培养法,对猴RF/6A细胞进行体外传代培养,选择20μ/ml的凝血酶作为诱导浓度,分别作用于RF/6A细胞2、4、6、8、10、12及24 h,用ELISA法观察凝血酶对视网膜血管内皮细胞表达TNF-α的诱导情况。观察在有或无凝血酶诱导下水蛭渗滤液(64 mg/ml)对视网膜血管内皮细胞表达TNF-α的影响。结果 (1)凝血酶作用2 h,TNF-α的表达开始增加,作用4 h,TNF-α的表达达到最大,持续至10 h;4、6、8 h与空白组比较差异均有统计学意义(P<0.05);当凝血酶作用时间达12 h,TNF-α的表达开始下降,凝血酶组与空白组12 h和24 h比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(2)水蛭渗滤液对有或无凝血酶诱导组都能下调TNF-α的表达(P<0.05)。结论水蛭渗滤液能下调凝血酶诱导下猴RF/6A细胞表达TNF-α。

水蛭酶提取工艺的研究

目的通过实验优选水蛭酶提取工艺条件。方法以体外的抗凝活力为指标,进行单因素试验,考察胃酶加入量、提取温度、提取时间、药液pH对有效成分提取的影响,用正交试验优选提取条件。结果优选的提取工艺为:温度42℃,pH1.5,加酶量为300U/g,提取4h。结论实验表明,此方法提取率高,工艺合理。

水蛭提取液对人视网膜母细胞瘤细胞的抑制作用

目的:研究水蛭提取液对人视网膜母细胞瘤WERI-RB-1细胞的抑制作用。方法:采用不同浓度水蛭提取液(0.02、0.04、0.08、0.16U/mL)作用于体外培养的WERI-RB-1细胞0、24、48、72h,经CCK-8法筛选最佳药物干预浓度和时间进行后续实验。将体外培养的WERI-RB-1细胞分为对照组(正常培养基培养)和实验组(含水蛭提取液培养基培养),采用流式细胞仪检测药物对细胞周期和细胞凋亡的影响,Transwell侵袭实验检测药物对细胞侵袭能力的影响。结果:根据CCK-8法检测结果选择0.04、0.08U/mL水蛭提取液作用48h为最佳干预条件进行实验。水蛭提取液干预的细胞主要阻滞在G2/M期,其中0.04、0.08U/mL实验组处于G2/M期的阳性细胞率分别为(12.59±5.36)%、(14.79±4.12)%,均明显高于对照组[(3.00±2.32)%,P<0.01]。水蛭提取液可诱导细胞凋亡,其中0.04、0.08U/mL实验组细胞凋亡率分别(37.91±3.44)%、(33.05±2.25)%,均明显高于对照组[(4.64±2.56)%,P<0.01]。Transwell侵袭实验检测结果显示,实验组Transwell小室下细胞数明显少于对照组,表明水蛭提取液能够抑制细胞侵袭。结论:水蛭提取液在体外实验中能够抑制人视网膜母细胞瘤细胞的增殖、侵袭,并诱导细胞凋亡。