杆状病毒LEF-11蛋白自身相互作用关键区域的鉴定

【目的】家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)是蚕业上最常见且危害最为严重的病原微生物之一,其晚期表达因子(late expression factor,lef)LEF-11对病毒的增殖具有重要作用,相关研究证明LEF-11蛋白能够发生自身相互作用形成寡聚体,本研究通过逐步截短探究LEF-11蛋白自身相互作用的关键区域。【方法】利用双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation)技术和荧光定位(fluorescent co-location)技术,首先根据Bm NVP lef-11及各个截短片段序列和荧光蛋白序列设计引物,通过PCR技术扩增回收得到所有片段以及荧光标签片段,并且通过限制性内切酶处理回收后,将荧光标签片段分别连接到昆虫细胞表达载体p IZ/V5-His上,构建p IZ-Ds Red和p IZ-EGFP质粒,然后用相同方法构建LEF-11全长和逐步截短的LEF-11红色荧光融合蛋白载体,分别与p IZ-LEF11-GFP共同转染到家蚕Bm N-SWU1细胞中,更换普通培养基48 h后固定细胞并制片,最后在荧光共聚焦显微镜下观察荧光融合蛋白表达及定位情况,鉴定LEF-11蛋白自身相互作用的关键区域;荧光双分子互补试验相关载体的构建步骤与荧光融合表达载体构建方法一致,转染处理及荧光观察方法也相同。【结果】杆状病毒LEF-11蛋白2—61和62—112端均能与LEF-11蛋白全长发生相互作用,分别共定位于细胞质和细胞核;逐步截短过程中,LEF-11蛋白N-端2—61、12—61、22—61、32—61、42—61和2—51均能与LEF-11蛋白全长共同定位于细胞质中,但其52—61、2—41未发生共定位;C-端截短片段能够与LEF-11蛋白全长发生共定位的有62—112、72—112、82—112、72—101和72—91,但92—112和72—81区域未发现共定位现象;双分子荧光互补试验结果验证LEF-11蛋白N-端片段与LEF-11蛋白全长相互作用的有2—61、12—61、22—61、32—61、42—61、2—51,而2—41、52—61截短突变体则不能,与N-端片段荧光共定位结果保持一致。【结论】鉴定到了杆状病毒LEF-11蛋白的42-51和82-91区域为其自身相互作用关键区域,可用于LEF-11相关功能研究。

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)lef-11基因在病毒感染宿主细胞中的表达特征

杆状病毒晚期表达因子(late expression factor,LEF)是参与病毒基因组DNA复制和病毒基因转录调控的一个重要家族,该家族成员LEF-11为13 k D的小分子蛋白质。通过比对目前已经测序的63种杆状病毒基因组序列,发现LEF-11的编码基因lef-11在除宿主为双翅目昆虫的Cuni NPV外的所有杆状病毒基因组中都存在,暗示lef-11基因可能在包括家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)在内的杆状病毒复制过程中行使重要功能。通过RT-PCR检测和Western blotting分析lef-11基因及其编码蛋白质在Bm NPV侵染的家蚕卵巢培养细胞Bm N中的转录与表达时相,其转录本从侵染后6h开始持续表达,蛋白质从侵染后12 h开始持续表达。当利用DNA聚合酶特异抑制剂阿非迪霉素(aphidicolin)阻断Bm NPV病毒基因组DNA复制之后检测LEF-11的表达受到抑制,暗示LEF-11的表达起始于病毒DNA复制之后。以上结果表明:BmNPV lef-11基因在杆状病毒中非常保守,是一个晚期表达基因,可能不直接参与病毒的起始复制,而是参与病毒的大规模复制过程。

家蚕核型多角体病毒lef-11基因RNA干扰策略的优化

【目的】家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)lef-11基因作为杆状病毒高度保守的晚期表达因子之一,对病毒晚期基因的表达极其重要。因此对lef-11基因进行有效RNA干扰将提高宿主细胞对BmNPV的抗性。【方法】本文基于经典的sh-RNA-loop骨架及家蚕内源性的miRNA骨架,构建以BmNPV lef-11基因为靶标的干扰载体pIZ-shRNA1、pIZ-shRNA2和pIZ-Ds RedamiR279;分别构建基于A4、IE1、IE1-295、IE2、IE2-339、hr3A4和hsp70启动子驱动的干扰载体,用以评价不同启动子驱动的干扰载体的抗病毒效果,并对干扰载体进行优化。【结果】首先,本文通过比较miRNA-based和shRNA-based RNAi载体对同一靶基因同一位点的干扰效率,发现pIZ-Ds Red-amiR279对BmNPV lef11基因的干扰效率超过90%,远优于shRNA-based RNAi载体的干扰效果;其次,通过对干扰载体进行优化,发现IE1启动子的效果最优,由其驱动的pIZ-Ds Red-milef11干扰载体也是本研究中的最优干扰载体,对病毒的增殖抑制效果最为明显。【结论】对目的基因的干扰效果并非启动子的活性越高、miRNA积累得越多就越好,只有综合考虑干扰片段的选择、启动子的活性以及靶基因自身的功能等多方面的因素,才能提高干扰效率,达到干扰目的。

灰斑古毒蛾核型多角体病毒三个晚期表达因子基因

将灰斑古毒蛾(Orgyiaericae)单粒包埋型核型多角体病毒(OrerSNPV)基因组DNA的各EcoRI酶切片段进行克隆和测序。序列分析结果表明EcoRI-M(3.0kb)与EcoRI-P片段(2.2kb)相连处含有编码晚期表达因子(LEF-2)的开放阅读框(ORF)。同时在EcoRI-E(约10kb)片段两端分别含有lef-3和lef-11基因的部分序列。lef-2基因编码区由648bp组成,可编码216个氨基酸残基的多肽,预计蛋白质分子量为23.7kDa。将OrerSNPVLEF-2氨基酸序列与其它已知的27种杆状病毒的LEF-2序列比较,发现OrerSNPV与其它鳞翅目NPVLEF-2氨基酸有35%～49%同源性,其中与BusuSNPV、MaMNPV-A、HezeSNPV、HearSNPV和LdMNPV同源性最高,和GV有26%～31%同源性,与膜翅目松柏锯角叶蜂NPV的同源性为32%,与库蚊杆状病毒的同源性只有23%。根据氨基酸序列绘制的分子进化树表明28种杆状病毒lef-2基因可以分为鳞翅目NPV、GV、膜翅目NeseNPV与双翅目CulexnigripalpusBaculovirus四个分支。OrerSNPVlef-2与BusuSNPV在进化树上关系最为接近,而OrerSNPVlef-3和LdMNPV的最接近,OrerSNPVlef-11则和SeMNPV的关系最接近。

中国棉铃虫核多角体病毒基因组XbaI-I片段的序列分析

报道了棉铃虫单核衣壳核多角体病毒 (HaSNPV)XbaI I片段的序列结构。该片段在基因组上定位于 18.4～2 2 .8m .u .,包括 8个完整的开放阅读框架和 p47的 5′端部分序列 :其中ubiquitin ,39K/pp31,lef - 11,p47,Ac34 ,Ac38和Lsel2 5homologue 7个基因是杆状病毒的同源基因 ,另外两个orf5 0 7和orf10 80是HaSNPV的特有基因 ,且具有典型的早期表达基因启动子的特征 ,经软件分析发现这两个基因推导的产物具有典型的跨膜压结构。序列比较分析表明 ,ubiquitin基因与其它杆状病毒的同源基因有相同的保守区 。