LV-ERK1-RNAi转染人非小细胞肺癌细胞的ERK1/2、DNA甲基转移酶1表达观察

目的观察细胞外信号调节激酶1基因RNA干扰慢病毒载体(LV-ERK1-RNAi)转染后人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞NCI-H1299中细胞外信号调节激酶1(ERK1)、ERK2、DNA甲基转移酶1(DNMT1) mRNA及ERK1、磷酸化ERK1(p-ERK1)、DNMT1蛋白表达情况。方法体外培养NCI-H1299细胞,将细胞随机分为3组,KD组和NC组细胞分别转染LV-ERK1-RNAi、阴性对照病毒,CON组不作处理。转染72 h后,采用荧光显微镜观察细胞荧光率,实时荧光定量基因扩增法检测细胞中ERK1/2、DNMT1 mRNA,蛋白免疫印迹法检测细胞中ERK1、p-ERK1、DNMT1蛋白。结果空白对照组细胞无绿色荧光蛋白表达,阴性对照病毒组、LV-ERK1-RNAi组转染效率达80%以上。与NC组、CON组比较,KD组ERK1、DNMT1 mRNA及ERK1、p-ERK1、DNMT1蛋白表达下降(P均<0. 05)。结论 LV-ERK1-RNAi转染后NCI-H1299细胞ERK1、DNMT1 mRNA及ERK1、p-ERK1、DNMT1蛋白表达降低,ERK2表达正常,表明LV-ERK1-RNAi特异敲低ERK1而调控DNMT1的表达。

稳定敲降NF-YB基因HeLa细胞系的构建

目的:利用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)技术,构建稳定敲降NF-YB基因的HeLa细胞系。方法:设计shRNA-NF-YB引物,利用分子克隆技术构建H1/GFP-Puro-shRNA-NF-YB质粒,转染293T后收集病毒感染HeLa细胞;用嘌呤霉素筛选细胞得到稳定敲降细胞株;利用Western blot和实时荧光定量PCR对细胞系进行鉴定。结果:构建的质粒经测序后与设计的引物对比序列一致,Western blot和实时荧光定量PCR结果表明构建细胞的NF-YB蛋白和mRNA表达抑制效果明显。结论:本实验成功构建了NF-YB-shRNA-HeLa细胞系,获得了特异性NF-YB基因敲降的HeLa细胞。

靶向沉默Eps8基因对人慢性髓系白血病K562细胞生物学活性的影响及其分子机制的探讨

目的:探索靶向沉默Eps8(表皮生长因子受体通路底物8)基因对人慢性髓系白血病K562细胞生物学活性的影响及其可能的分子机制。方法:采用慢病毒介导RNA干扰技术靶向沉默K562细胞中Eps8基因。实验分组为:空白对照(blank control)组、Eps8-shRNA靶向沉默(K562-shRNA)组和阴性对照(K562-NC)组。在荧光显微镜下观察转染效率;应用RT-PCR法和Western blot法分别从mRNA转录水平和蛋白水平验证Eps8基因沉默效率;台盼蓝拒染法和MTT法检测细胞体外增殖能力变化;流式细胞术检测细胞凋亡率变化;甲基纤维素克隆形成实验验证细胞集落形成能力;Western blot法检测沉默Eps8基因后AKT/mTOR及其下游信号通路磷酸化蛋白的表达情况。结果:成功建立稳定低表达Eps8的K562细胞株(K562-shRNA)和阴性对照细胞株(K562-NC)。与空白对照组和K562-NC组相比,沉默Eps8基因后K562-shRNA组细胞Eps8转录和蛋白表达水平均显著降低(P<0.01);体外培养48 h后,K562-shRNA组细胞增殖能力明显下降(P<0.05);K562-shRNA组细胞凋亡率为(5.81±0.39)%,空白对照组和K562-NC组细胞凋亡率分别为(1.02±0.70)%和(1.19±0.15)%,提示K562-shRNA组细胞凋亡率与空白对照组和K562-NC组之间有显著性差异(P<0.05),而空白对照组和K562-NC组之间没有显著性差异(P>0.05);体外甲基纤维素半固体培养10 d后,K562-shRNA组细胞集落形成能力与空白对照组和K562-NC组相比有显著性差异(P<0.05)。沉默Eps8基因可下调K562细胞p-AKT(308)和p-AKT(473)的表达(P<0.05),而t-AKT表达水平没有明显变化。另外,沉默Eps8基因可下调AKT下游的pmTOR和p-PRAS40蛋白的表达(P<0.05),而总mTOR和总PRAS40的表达水平没有明显变化。结论:利用慢病毒介导的RNA干扰技术靶向沉默Eps8基因能够抑制K562细胞增殖,促进其凋亡,其作用机制可能与AKT/mTOR及其下游信号通路下调有关。

PrxⅡ基因敲降L02细胞系的构建及其对细胞增殖的影响

构建PrxⅡ基因敲降L02细胞系并确定PrxⅡ基因对L02细胞增殖的影响。利用慢病毒介导的shRNA干扰技术、流式细胞术、荧光显微照相、蛋白质免疫印迹、MTT asssay等方法建立并检验PrxⅡ敲降L02细胞系及其对L02细胞的增殖影响。结果显示:选用5’-CCGCTTGTCTGAGGATACGTT-3’片段作为干扰PrxⅡ基因片段,利用慢病毒敲降L02细胞。同时处理嘌呤霉素筛选得到shPrxⅡ组细胞和Scramble组细胞,使用流式细胞术、荧光显微照相技术对shPrxⅡ组细胞和Scramble组细胞进行检测,结果均显示出GFP蛋白表达;此后利用蛋白质免疫印迹法检测出shPrxⅡ组细胞中PrxⅡ蛋白表达水平较Blank、Scram-ble组显著降低(P<0.05),Blank组与Scramble组细胞中PrxⅡ蛋白表达水平无明显差异。在MTT结果中显示shPrxⅡ组细胞增殖速率明显高于Scramble组,且具有统计学意义。成功构建PrxⅡ敲降的L02细胞系,发现PrxⅡ敲降后显著提高L02细胞的增殖速率。

慢病毒介导RNA干涉Cbl-b抑制A549细胞增殖机制研究

目的探讨敲减Cbl-b对程序性死亡配体1(programmed cell death-ligand 1, PD-L1)蛋白表达及肺腺癌A549细胞增殖能力的影响。方法对数生长期A549细胞分为对照组和敲减组,2组采用慢病毒感染法转染目的基因,对照组转染空载体,敲减组转染慢病毒介导的干涉Cbl-b基因,转染后72 h采用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白情况,判断转染效率。采用MTT法检测2组细胞转染成功后第1～5天细胞增殖率,采用Western blot检测2组细胞转染后Cbl-b蛋白相对表达量及转染成功后第3、4天PD-L1、Ki-67蛋白相对表达量。结果转染后,敲减组细胞Cbl-b蛋白相对表达量(0.18±0.03)低于对照组(0.75±0.01)(P<0.05);转染后第4、5天,敲减组细胞增殖率[(59.6±0.4)%、(87.2±1.4)%]低于对照组[(65.5±1.7)%、(98.2±2.8)%](P<0.05);转染后第3、4天,敲减组细胞PD-L1(0.51±0.00、0.55±0.02)和Ki-67蛋白相对表达量(0.35±0.01、0.25±0.00)低于对照组(0.55±0.01、0.67±0.02,0.47±0.01、0.33±0.02)(P<0.05),敲减组转染后第4天PD-L1相对表达量高于第3天,Ki-67蛋白相对表达量低于第3天,但差异均无统计学意义(P>0.05)。结论转染慢病毒介导RNA干涉Cbl-b基因能抑制A549细胞Cbl-b蛋白表达及细胞增殖;该过程伴随PD-L1表达上调和Ki-67表达下调。