食管鳞癌中microRNA let-7a-3甲基化与IGF-Ⅱ的相关性

目的探讨食管鳞癌组织中microRNA let-7a-3甲基化状态与血浆中类胰岛素样生长因子2(Insulin like growth factor 2,IGF-Ⅱ)表达的相关性。方法采用甲基化特异性PCR法(Methylation specific PCR,qMSP)检测83例食管癌及相对应的癌旁正常组织中let-7a-3甲基化状态,采用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血浆中IGF-Ⅱ的表达水平。结果83例食管鳞癌患者癌组织中的microRNA let-7a-3甲基化程度显著高于癌旁正常组织(P<0.001)。83例食管鳞癌患者血浆中IGF-Ⅱ的表达水平与let-7a-3基因的甲基化程度总体上呈正相关,具有统计学意义(r=0.600,P<0.001)。结论microRNA let-7a-3可能通过对下游分子的甲基化调控参与食管鳞癌的发生发展,这对了解食管鳞癌形成的机制具有重要意义,可为食管鳞癌的诊断和预后提供依据。

microRNA let-7a-3基因甲基化与糖尿病肾病的关系

目的探讨微RNAlet-7a-3基因启动子甲基化与糖尿病肾病的关系。方法采用生物信息学方法预测let-7a-3基因启动子区域甲基化位点,采用real-time PCR及甲基化特异性PCR检测20例糖尿病肾病(DN)患者、20例糖尿病患者(DM)以及20例正常对照(CON)的let-7a-3表达水平及启动子区域甲基化水平。结果 let-7a-3在DN组呈低表达。同时,DN组的平均甲基化率为96.2%±6.2%,DM组的平均甲基化率为76.6%±18.9%,正常组的平均甲基化率为63.2%±28.4%。DN组的平均甲基化水平较DM组和正常组显著增高(P<0.01)。结论 let-7a-3启动子区域高甲基化可能是糖尿病肾病患者let-7a-3低表达的一个重要因素,并参与调控糖尿病肾病的发生与发展。

宫颈鳞癌患者血浆miRNA let-7a-3p表达及其临床意义

子宫颈鳞癌在妇科恶性肿瘤最常见,病死率也高,每年全球新发病例超45万之多,是严重威胁女性健康的恶性疾病之一,近年研究发现宫颈癌发病逐渐趋于年轻化[1],其也是我国重点防治癌症之一。宫颈癌的发生是一个多因素、多阶段的发展过程,因此尽早诊断,及时采取相应治疗措施,是降低宫颈癌死亡率以及改善患者生活质量的关键。人乳头状瘤病毒(HPV)感染,尤其是高危型HPV的感染是导致宫颈癌发生的主要危险因素。

Let-7a-3p靶向IGF1R抑制人肺癌A549细胞中肿瘤干细胞的活性

目的:研究let-7a-3p对人肺癌细胞A549的肿瘤干细胞活性的影响及其相关机制。方法:RT-qPCR法比较肺癌细胞系A549、NCI-H1299、SPC-A1、H1650和HCC-827及人正常支气管上皮细胞系BEAS-2B中let-7a-3p的水平。A549肺癌细胞株分别转染let-7a-3p模拟物(let-7a-3p mimics)和其阴性对照(negative control mimic),分别作为let-7a-3p组和negative control组,并设立未转染对照(non-transfected)组,采用RT-qPCR法检测各组细胞let-7a-3p的水平。瘤球形成实验检测3组肿瘤干细胞瘤球形成能力。流式细胞术检测肿瘤干细胞比例。Western blot法检测3组细胞NANOG、OCT4和胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)的蛋白表达水平。运用生物信息学方法预测let-7a-3p的靶基因,双萤光素酶实验检测let-7a-3p与IGF1R的关系。Western blot法检测IGF1R过表达对let-7a-3p抑制肿瘤干细胞的拮抗作用。建立皮下移植瘤模型观察let-7a-3p的体内作用。结果:肺癌细胞系中let-7a-3p的表达水平均明显低于正常支气管上皮细胞系(P<0.01)。let-7a-3p组A549细胞中let-7a-3p的表达水平较non-transfected组明显上调(P<0.01)。瘤球形成实验发现,let-7a-3p组的瘤球数量明显低于non-transfected组。流式细胞术检测发现,let-7a-3p组的CD133^+细胞比例明显低于non-transfected组(P<0.01)。Western blot实验显示,let-7a-3p组的NANOG蛋白和OCT4蛋白表达量比non-transfected组明显降低(P<0.01)。生物信息学预测结果表明,let-7a-3p与IGF1R的3’-UTR区部分互补,IGF1R可能是let-7a-3p的靶基因。双萤光素酶实验证实,IGF1R为let-7a-3p的直接下游靶基因。Let-7a-3p组的IGF1R蛋白表达量明显降低(P<0.01)。Let-7a-3p组的皮下移植瘤明显小于non-transfected组。结论:let-7a-3p可能通过降低下游靶基因IGF1R的水平影响肺癌干细胞相关蛋白表达,抑制肺癌干细胞潜能。

let-7a-3基因表达与急性髓系白血病的相关性

目的:通过检测急性髓系白血病(AML)患者骨髓单个核细胞(BMMNC)中let-7a-3基因的表达水平,探讨其与临床变量的相关性。方法:应用RQ-PCR方法检测83例初诊AML患者BMMNC中let-7a-3基因表达水平,分析其与患者年龄、性别、血象、诊断分型和7个基因(FLT3-ITD,NPM1,C-KIT,IDH1/IDH2,DNMT3A,C/EBPA and N/K-RAS)突变的关系。结果:20例(24%)AML患者存在着let-7a-3转录本的过表达;let-7a-3基因过表达阳性组与阴性组在年龄、性别、血象、FAB亚型和突变基因之间均无显著性差异(P>0.05);let-7a-3基因过表达阳性组与阴性组的总体生存(OS)时间并无显著差异(P>0.05),但在治疗后获得完全缓解的患者中let-7a-3基因过表达阳性组与阴性组的总体生存时间差异有显著性(P=0.003)。结论:let-7a-3基因过表达是AML中的一个常见分子事件。

Let-7a-3p通过靶向AMPK对肺癌细胞系A549能量代谢及凋亡的影响

目的探讨转染Let-7a-3p对肺癌细胞能量代谢及凋亡影响及机制。方法根据肺癌A549细胞处理不同分为A549组、Let-7a-3p组(转染Let-7a-3p mimics)、阴性对照组(negative control mimic,NC)和未转染对照(non transfected,NT)组。采用RT-qPCR法检测各组细胞Let-7a-3p的水平,CCK8法检测细胞活力,海马细胞能量代谢实时测定仪XF分析测定氧耗率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR),流失细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测Let--7a-3p、Bcl-2、Caspase--3、Ras及AMPK蛋白的表达。结果Let-7a-3p组Let-7a-3p表达水平明显上调(P<0.01),而NC组Let-7a-3p表达水平与A549组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。CCK-8法检测结果显示,与A549及NC组比较,Let-7a-3p组活细胞相对数明显减少(P<0.01)。能量代谢实时测定仪XF分析结果显示,与A549、NC组比较,转染Let-7a-3p后A549细胞的氧耗率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)减少(P<0.01)。流失细胞术检测结果显示,与A549组比较,Let-7a-3p组细胞凋亡率增多(P<0.01)。Western blot检测结果显示,过表达Let-7a-3p可以使A549细胞中Caspase-3与AMPK蛋白上调(P<0.01),而Bcl-2与Ras蛋白下调(P<0.01)。结论Let-7a-3p模拟物可以抑制肺癌细胞A549的活性和能量代谢并促进其凋亡。Let-7a-3p模拟物作用于癌细胞的机制可能是通过上调AMPK及Caspase-3蛋白水平,下调Bcl-2与Ras蛋白水平,从而触发能量代谢和凋亡通路,降低MMP,从而抑制ATP的产生。

慢性髓系白血病中let-7a-3甲基化态势及其临床意义

目的探讨慢性髓系白血病(CML)患者中let-7a-3启动子的甲基化态势及其临床意义。方法建立实时定量甲基化特异性PCR(RQ-MSP)分别检测25例对照者及52例CML患者骨髓单个核细胞中let-7a-3启动子未甲基化水平。结果 52例CML患者未甲基化let-7a-3启动子(59.6%)为阳性,而对照组仅1例(4%)阳性,两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。ROC曲线分析表明,let-7a-3启动子未甲基化作为辅助诊断CML有较好的特异性。未甲基化let-7a-3启动子水平与BCR/ABL融合基因转录水平呈显著正相关(r=0.641,P=0.001),但与患者的白细胞、血小板计数及血红蛋白水平无明显相关性(P>0.05)。在慢性期和加速期let-7a-3未甲基化水平显著高于急变期。结论 let-7a-3基因低甲基化水平随疾病进展而降低。

microRNA let-7a-3调节结直肠癌中RAB11FIP2的表达

目的探索microRNA let-7a-3在结直肠癌(CRC)中的表达状态、生物学功能及可能的机制。方法使用联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法(COBRA)或亚硫酸氢盐测序法(BSP)分析let-7a-3启动子内的DNA甲基化状态。使用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测CRC细胞系中let-7a-3和RAB11FIP2的表达。使用流式细胞仪和锚定-非依赖性生长试验检测let-7a-3表达上调时CRC细胞凋亡水平及集落形成能力。结果let-7a-3基因甲基化在CRC组织中很常见,let-7a-3的甲基化状态与组织来源有关(P<0.001)。去甲基化剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-aza-dC)可以诱导let-7a-3的表达。let-7a-3表达上调时促进细胞凋亡并抑制细胞集落形成能力(P<0.001)。let-7a-3通过靶向RAB11FIP2基因3’-UTR区域中的同源DNA区域抑制RAB11FIP2的表达。结论CRC中let-7a-3甲基化是一种常见现象,let-7a-3过表达可诱导细胞凋亡,抑制锚定非依赖性生长,提示let-7a-3可能是结直肠癌治疗的潜在生物标志物。

TGFβR3基因3’UTR双荧光素酶报告载体的构建及其与miR-let-7a靶向关系的验证

目的:构建Ⅲ型转化生长因子β受体(TGFβR3)基因3’非编码区(3’UTR)双荧光素酶报告载体,并分析其与miR-let-7a的靶向关系。方法:根据micro RNA靶基因预测软件targetscan获取miR-let-7a与TGFβR3基因3’UTR潜在的互补结合位点;PCR扩增出TGFβR3基因3’UTR序列并克隆至pGEM-T载体,定点突变潜在互补结合位点后双酶切pGEM-T载体获取目的片段并插入至双荧光素酶报告载体获得野生型和突变型重组双荧光素酶报告载体,测序鉴定;将2种载体分别与miR-let-7a mimics或miR-let-7a NC共同转染HEK293T细胞,收集细胞后通过双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性。结果:经测序鉴定成功构建野生型和突变型重组荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告系统检测显示,共转染miR-let-7a mimics和野生型双荧光素酶报告载体的荧光素酶活性比miR-let-7a NC组明显降低(P<0.05),而共转染突变型双荧光素酶报告载体后其荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论:成功构建TGFβR3基因3’UTR双荧光素酶报告载体,并证实TGFβR3基因是新发现的miR-let-7a直接靶向调控基因。

微小RNA-let-7a对黑素瘤细胞系A375细胞凋亡的影响

目的 研究微小RNA（microRNA）-let-7a对黑素瘤细胞系A375细胞凋亡的影响及其作用机制.方法 采用实时荧光定量PCR法（TaqMan探针法）检测microRNA-let-7a在A375细胞及黑素细胞的表达差异;然后用microRNA-let-7a的模拟物转染A375细胞,流式细胞仪检测其凋亡的改变;最后采用Western印迹检测转染后半胱天冬酶-3（caspase-3）蛋白的变化.结果 与黑素细胞相比,microRNA-let-7a在A375细胞中表达下降了0.462倍;采用microRNA-let-7a的模拟物转染后,与阴性对照（细胞凋亡率16.9%）相比,A375细胞凋亡（细胞凋亡率47.4%）增加;转染后caspase-3蛋白表达下调.结论 microRNA-let-7a可促进黑素瘤细胞系A375的凋亡,同时下调caspase-3蛋白的表达.

IL-6/STAT3通路介导lncRNA H19上调在小鼠溃疡性结肠炎相关结直肠癌发病中的作用

目的:检测长链非编码RNA H19 (lncRNA H19,H19)和白细胞介素6/信号传导及转录激活蛋白3 (IL-6/STAT3)通路在小鼠溃疡性结肠炎相关结直肠癌(CAC)组织中的表达,并探讨其可能的作用机制。方法:22只C57BL/6小鼠随机分为对照组(n=10)和模型组(n=12),模型组小鼠采用氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠(AOM/DSS)联合诱导建立CAC小鼠模型。第120天处死小鼠,评估小鼠疾病活动度(DAI),计算成瘤率,测量结肠长度,HE染色观察小鼠结肠组织病理形态表现,ELISA法检测小鼠血清IL-6水平,qPCR法检测小鼠结肠组织中H19、let-7a、IL-6、STAT3和c-Myc mRNA表达水平,Western blotting法检测小鼠结肠组织中磷酸化STAT3 (p-STAT3)和c-Myc蛋白表达水平。结果:与对照组比较,模型组小鼠成瘤率为100%,结肠长度明显缩短(P<0.01),DAI评分增加,HE染色显示结肠组织呈上皮内瘤变,结肠组织中H19、IL-6、STAT3和c-Myc mRNA表达水平均明显升高(P<0.01),let-7amRNA表达水平明显降低(P<0.01),血清IL-6水平升高(P<0.01),结肠组织中p-STAT3和c-Myc蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。结论:小鼠CAC的发病可能与IL-6/STAT3通路介导的c-Myc和H19表达上调及let-7a表达下调有关。

miR-let-7a调节PI3K/Akt信号通路抑制人系膜细胞增殖和炎症反应

为探究miR-let-7a对LPS诱导的人系膜细胞(human mesangial cell,HMC)增殖和炎症反应的影响及其通过调节PI3K/Akt信号通路发挥作用的机制,体外条件下用0.1μg/mL LPS处理HMC,CCK-8法检测各时间点细胞活性;Western blotting检测HMC增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、凋亡相关蛋白BAX及信号通路蛋白PI3K、p-Akt的表达情况;qPCR检测细胞中miR-let-7a及炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6和Ⅳ型胶原蛋白mRNA的表达。转染miR-let-7a mimic或inhibitor改变HMC中miR-let-7a的表达,或使用抑制剂LY294002阻断HMC中PI3K/Akt信号通路,观察不同处理对HMC增殖、炎症反应及PI3K/Akt信号通路激活的影响。结果显示,LPS处理可诱导HMC增殖和炎症反应,抑制miR-let-7a的表达(均P<0.05)并激活PI3K/Akt信号通路(均P<0.01);与LPS组相比,过表达miR-let-7a可下调LPS诱导的HMC增殖和炎症反应,抑制PI3K/Akt信号通路的激活(均P<0.05);反之,下调miR-let-7a水平可促进由LPS刺激引起的细胞增殖、炎症反应及PI3K/Akt信号通路激活(均P<0.05);阻断PI3K/Akt信号通路也可抑制HMC的活性和炎性因子产生(均P<0.05)。综上,在经LPS处理的HMC中,miR-let-7a可通过调节PI3K/Akt信号通路抑制HMC的增殖与炎症反应。

Let-7a对尤文肉瘤干细胞恶性表型的影响及其可能的机制

目的:探讨微RNA let-7a对尤文肉瘤中肿瘤干细胞恶性表型的影响及其可能的分子作用机制。方法:采用侧群(side population,SP)细胞分选法分选出尤文肉瘤A673和SK-ES-1细胞中的肿瘤干细胞样细胞,并进行鉴定。采用实时荧光定量PCR法检测SP细胞与非SP(non-SP)细胞中let-7a的表达差异。将人工合成的let-7a模拟物(let-7a mimic)分别转染至A673和SK-ES-1的SP细胞中,随后通过细胞集落形成实验和Transwell小室侵袭实验分别检测let-7a对SP细胞集落形成和侵袭能力的影响。蛋白质印迹法检测SP细胞和non-SP细胞中信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)及其下游的磷酸化STAT3(phospho-STAT3,p-STAT3)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP2)蛋白的表达差异,以及转染let-7a mimic后SP细胞中这些蛋白表达水平的变化。结果:成功分离出尤文肉瘤A673和SK-ES-1细胞中的肿瘤干细胞样SP细胞,并发现SP细胞中干细胞相关蛋白SOX2和CD133的表达水平均明显上调(P值均<0.01)。与non-SP细胞相比,SP细胞中let-7a呈低表达(P<0.01),而STAT3信号通路相关蛋白STAT3、p-STAT3和MMP2明显高表达(P值均<0.01),细胞集落形成能力和侵袭能力均明显升高(P值均<0.05)。let-7a过表达的尤文肉瘤SP细胞中,细胞集落形成能力和侵袭能力均较阴性对照组明显降低(P值均<0.05),而且STAT3及其下游p-STAT3和MMP2蛋白表达水平较阴性对照组均明显下调(P值均<0.01)。结论:尤文肉瘤干细胞中Let-7a低表达。过表达let-7a可能通过STAT3信号通路介导抑制尤文肉瘤干细胞的集落形成和侵袭能力。

一种新型miRNA功能测定系统的建立

找到一种降低内源microRNA(miRNA)背景对let-7a荧光效应元件干扰的方法。选择Hela细胞系作为工具细胞系,先分别转染敲除miRNA加工成熟通路上的蛋白Dicer1,Drosha的siRNA表达载体,或转染直接敲除内源miRNAlet-7a的siRNA表达载体,然后再次转染含有let-7a靶点HMGA2 3’UTR的荧光效应元件,之后观测let-7a荧光效应元件荧光恢复程度。结果显示pcDNA3-H1-sh-A-R-let-7a对含有HMGA2 3’UTR的荧光效应元件恢复荧光的效果最好。