Lin28对肝癌HepG2细胞5-Fu敏感性的影响及其分子机制

目的:探讨RNA结合蛋白Lin28对肝癌HepG2细胞5-氟尿嘧啶(5-Fu)敏感性的影响及其机制。方法:应用pcDNA3.1-Lin28或si-Lin28转染HepG2细胞,采用q PCR及WB法检测转染后HepG2细胞Lin28的表达水平,CCK-8法检测5-Fu作用后转染细胞增殖活性变化并计算5-Fu对细胞作用的IC50,流式细胞术检测5-Fu处理后细胞凋亡情况、WB法检测凋亡相关蛋白的表达变化,qPCR法检测转染后耐药相关miRNA(let-7a和let-7b)及肿瘤干细胞标记物(Oct4、Nanog和Sox2)的mRNA表达水平。结果:与空载对照组(HepG2/Vector)相比,HepG2/Lin28组细胞中Lin28 mRNA和蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01),过表达Lin28可显著抑制HepG2细胞对5-Fu作用的敏感性(IC50明显升高,P<0.05)和增强细胞增殖活性、使细胞凋亡率和凋亡相关蛋白caspase-3表达明显降低(均P<0.01)。与阴性对照组(si-control)相比,si-Lin28细胞中Lin28表达水平显著下降(P<0.01);敲减Lin28可使细胞增殖活性及5-Fu的IC50显著降低(均P<0.01),凋亡率及凋亡蛋白表达明显增加(P<0.01)。与HepG2/Vector组比较,HepG2/Lin28细胞中let-7a、let-7b及肿瘤干细胞标记物(Oct4、Nanog和Sox2)的表达水平明显上调(均P<0.01),而si-Lin28细胞中let-7a、let-7b及Oct4、Nanog、Sox2的表达水平较si-control组明显下调(均P<0.01)。结论:Lin28可通过调节miRNAs的表达及肿瘤干细胞的形成从而调节肝癌HepG2细胞对化疗的敏感性,靶向调节Lin28表达有望成为提高肝癌化疗疗效的手段。

miR-218-5p通过靶向LIN28B调控COPD时气道上皮细胞凋亡和炎症反应

目的探讨miR-218-5p通过靶向LIN28B调控慢性阻塞性肺疾病(COPD)时气道上皮细胞凋亡和炎症反应的作用及其机制。方法将人肺支气管上皮细胞BEAS-2B分为正常对照(NC)组、香烟烟雾提取物(CSE)组、miR-NC+CSE组、miR-218-5p+CSE组、si-NC+CSE组、si-LIN28B+CSE组、miR-218-5p+pcDNA-NC+CSE组和miR-218-5p+pcDNA-LIN28B+CSE组。RT-qPCR检测miR-218-5p的表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测白细胞介素6(IL-6)和转化生长因子-β1(TGF-β1)的表达水平;蛋白质印记(Western blot)检测LIN28B、裂解的天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase-3)的表达水平;双荧光素酶报告基因实验验证miR-218-5p对LIN28B的靶向作用。结果与NC组比较,CSE组BEAS-2B细胞miR-218-5p表达降低,细胞凋亡率、LIN28B、Cleaved-caspase-3、IL-6和TGF-β1表达显著增加(均P<0.05)。与miR-NC+CSE组比较,miR-218-5p+CSE组BEAS-2B细胞凋亡率、Cleaved-caspase-3、IL-6和TGF-β1表达显著降低(均P<0.05)。与si-NC+CSE组比较,si-LIN28B+CSE组BEAS-2B细胞凋亡率、Cleaved-caspase-3、IL-6和TGF-β1表达显著降低(均P<0.05)。与miR-218-5p+pcDNA-NC+CSE组比较,miR-218-5p+pcDNA-LIN28B+CSE组BEAS-2B细胞细胞凋亡率、Cleaved-caspase-3、IL-6和TGF-β1表达显著增加(均P<0.05)。结论miR-218-5p通过靶向LIN28B可抑制CSE诱导的气道上皮细胞凋亡和炎症反应。因此,miR-218-5p可能是慢性阻塞性肺疾病的潜在治疗靶点。

miR-4500通过转录后下调LIN28B表达抑制乳腺癌细胞的迁移和增殖

目的观察微小RNA(miRNA,miR)-4500通过转录后下调LIN-28同系物B(lin-28 homolog B,LIN28B)基因表达对乳腺癌细胞HCC1937迁移和增殖的抑制作用。方法采用实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测乳腺癌细胞系(MB-MDA-468、MCF7、SKBR3、HCC1937)中miR-4500的表达。以miR-4500表达最低的乳腺癌细胞系(HCC1937)为对象,分别转染miR-4500模拟物和miR-NC,命名为miR-4500组和miR-NC组。real-time PCR检测转染效果。Transwell实验和噻唑蓝(MTT)实验检测转染后乳腺癌细胞迁移和增殖能力。生物信息学软件预测和双荧光素酶报告实验验证miR-4500的靶基因。real-time PCR和Western blot检测乳腺癌细胞中靶基因的表达。结果miR-4500在乳腺癌细胞系的表达显著低于正常乳腺上皮细胞(P<0.05),并在HCC1937细胞中表达最低(P<0.01)。miR-4500组miR-4500的表达(11.60±1.08)显著高于miR-NC组(1.22±0.48),差异有统计学意义(P<0.01)。与miR-NC组比较,miR-4500组细胞迁移和增殖能力均显著降低(P<0.05)。生物信息学软件显示miR-4500的靶基因是LIN28B。双荧光素酶报告实验证明miR-4500可靶向结合LIN28B基因(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-4500组HCC1937细胞中LIN28B的表达显著降低(P<0.05)。结论LIN28B基因是miR-4500的靶基因,miR-4500可通过转录后下调LIN28B基因表达抑制乳腺癌细胞HCC1937的迁移和增殖能力。

瑞芬太尼通过调控miR-212-3p/LIN28B表达影响子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和侵袭

目的探讨瑞芬太尼对子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及作用机制。方法不同浓度(0、5、50、500 ng/ml)的瑞芬太尼干预子宫内膜癌Ishikawa细胞24 h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖抑制率,Transwell法检测细胞迁移和侵袭,Western印迹检测细胞中细胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9和LIN28B蛋白表达,qRT-PCR检测Ishikawa细胞中miR-212-3p和LIN28BmRNA表达。分别转染miR-NC、miR-212-3p mimics、si-NC、si-LIN28B至Ishikawa细胞,用不含瑞芬太尼的培养基干预24 h后,上述相同方法检测细胞增殖、迁移和侵袭及相关蛋白表达。转染anti-miR-NC、anti-miR-212-3p至Ishikawa细胞,并用含500 ng/ml瑞芬太尼的培养基干预24 h,上述相同方法检测细胞增殖、迁移和侵袭及相关蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验验证miR-212-3p与LIN28B的靶向调控关系。结果瑞芬太尼可剂量依赖性提高Ishikawa细胞增殖抑制率及细胞中p21蛋白表达(P<0.05),而降低细胞迁移数、侵袭数及CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达。同时,瑞芬太尼促进Ishikawa细胞中miR-212-3p的表达(P<0.05),而抑制LIN28B表达(P<0.05)。过表达miR-212-3p或抑制LIN28B表达均提高Ishikawa细胞增殖抑制率及细胞中p21蛋白表达(P<0.05),而降低细胞迁移数、侵袭数及CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达(P<0.05)。miR-212-3p在Ishikawa细胞中负向调控LIN28B表达,抑制miR-212-3p表达逆转了瑞芬太尼对Ishikawa细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结论瑞芬太尼可抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖、迁移和侵袭,其可能通过调控miR-212-3p/LIN28B轴发挥作用。

miR-128-3p靶向Lin28B增加肝癌细胞对奥沙利铂的敏感性

目的研究miR-128-3p与肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞对奥沙利铂敏感性的影响,并探讨其作用机制.方法采用qRT-PCR法检测人正常肝细胞HL-7702、HCC细胞BEL-7402和Hep-3B中miR-128-3p、Lin28B的表达;将对数生长期的HCC细胞BEL-7402、Hep-3B随机分成miR-128-3pmimics组(转染miR-128-3Pmimics)、miR-NC组(未转染细胞)、Lin28B-3'UTR WT组(载体psiCHECK2-Lin28B-3'UTR WT和miR-128-3p共转染)、Lin28B-3'UTRMUT组(载体psiCHECK2-Lin28B-3'UTRMUT和miR-NC共转染)和miR-128-3p+Lin28B组(miR-128-3p和Lin28B共转染)、si-Lin28B组(转染si-Lin28B)和si-NC组(转染沉默对照),均以脂质体转染.采用MTT法检测各组细胞的存活率和活力; Western Blot检测各组细胞的蛋白表达.结果与人正常肝细胞相比, HCC细胞BEL-7402和Hep-3B中miR-128-3p的表达较显著降低(P<0.01), Lin28B的表达较显著升高(P<0.01),且过表达miR-128-3p、沉默Lin28B均可抑制HCC细胞增殖,促进凋亡,增加HCC细胞对奥沙利铂的敏感性.Lin28B为mi R-128-3p的靶标,且回补Lin28B可逆转mi R-128-3p增加HCC细胞对奥沙利铂敏感性的作用.结论miR-128-3p可增加HCC细胞对奥沙利铂的敏感性,其作用机制可能与靶向Lin28B有关,提示miR-128-3p可作为抗奥沙利铂耐药性的潜在靶点.

瑞芬太尼在子宫内膜癌细胞增殖及迁移中的调节机制及对miR-212-3p/LIN28B通路的影响

目的:探讨子宫内膜癌细胞采用瑞芬太尼的干预效果及对增殖、迁移与miR-212-3p/LIN28B通路的影响。方法:①子宫内膜癌Ishikawa细胞放置在4个试管中,给予瑞芬太尼5、50、500 ng/ml 24 h培养,以瑞芬太尼0 ng/ml为对照组;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖抑制率,实时荧光PCR法检测miR-212-3p、LIN28B mRNA表达水平,Western blot法检测细胞周期蛋白(Cyclin D1)、基质金属蛋白酶(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及LIN28B蛋白表达水平,采用Transwell法测定四组细胞迁移及侵袭率。②子宫内膜癌Ishikawa细胞中转染miR-NC、miR-212-3p mimics、si-NC及si-LIN28B,并采用500 ng/ml瑞芬太尼处理,采用上述方法评估细胞的增殖和迁移。结果:四组24 h细胞增殖率比较无统计学差异(均P>0.05);且细胞增殖抑制率呈瑞芬太尼药物剂量依赖性;实时荧光PCR法测定结果表明:四组不同浓度瑞芬太尼处理后miR-212-3p mRNA呈上升趋势(均P<0.05),而LIN28B mRNA水平呈下降趋势(P<0.05),并呈剂量依赖性;Western blot结果表明:四组Cyclin D1、MMP-2、MMP-9及LIN28B蛋白表达比较差异具有统计学意义(均P<0.05),随着瑞芬太尼药物剂量增加,其表达水平呈下降趋势;随着瑞芬太尼浓度增加,迁移细胞数与侵袭细胞数下降明显,并表现出剂量依赖性;miR-NC组细胞增殖抑制率低于miR-212-3p mimics组(P<0.05),迁移细胞数、侵袭细胞数高于miR-212-3p mimics组(均P<0.05);抑制LIN28B蛋白后si-LIN28B细胞增殖抑制率高于si-NC组(P<0.05),迁移细胞数、侵袭细胞数及LIN28蛋白均低于si-NC(均P<0.05);瑞芬太尼500 ng/ml+anti-miR-212-3p组miR-212-3p、细胞增殖抑制率低于瑞芬太尼500 ng/ml+anti-miR-NC组(均P<0.05),LIN28B蛋白、迁移细胞数及侵袭细胞数高于瑞芬太尼500 ng/ml+anti-miR-NC组(均P<0.05)。结论:瑞芬太尼能抑制子宫内膜癌细胞生物学活性,可能与药物调控miR-212-3p/LIN28B通路有关。

成人头颈部横纹肌肉瘤组织中lin-28同源基因B的表达及临床意义

目的探讨成人头颈部横纹肌肉瘤组织中lin-28同源基因B(LIN28B)的表达及临床意义。方法收集2009年1月至2015年12月我院22例年龄≥16周岁的头颈部横纹肌肉瘤患者的肿瘤组织,以及5例因其他实体肿瘤行手术切除患者的正常横纹肌组织(阴性对照)。采用免疫组织化学染色检测肿瘤组织中LIN28B蛋白的表达,并分析其表达与成人头颈部横纹肌肉瘤患者临床病理参数(性别、年龄、组织学类型、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期、危险分组及颅底骨质破坏)和预后的关系。结果免疫组织化学染色结果显示LIN28B蛋白在正常横纹肌组织中呈阴性表达,而在成人头颈部横纹肌肉瘤组织中呈阳性表达,阳性表现为细胞质染色呈棕黄色。根据组织学评分,12例成人头颈部横纹肌肉瘤患者的LIN28B表达呈低表达(0~3分),10例呈高表达(≥4分)。LIN28B在非胚胎性横纹肌肉瘤、肿瘤大小>5 cm患者的肿瘤组织中表达水平较高(P=0.020、0.030);LIN28B表达与患者性别、年龄、淋巴结转移与否、TNM分期、危险分组及颅底骨质破坏与否无关(P均>0.05)。22例成人头颈部横纹肌肉瘤患者中位随访时间为78.4个月,中位无进展生存期及中位总生存期分别为12.4个月及17.9个月,5年无进展生存率及总生存率分别为11.4%及13.6%。LIN28B低表达成人头颈部横纹肌肉瘤患者的中位无进展生存期为17.9个月,长于高表达者的8.2个月(P=0.003);LIN28B低表达者的中位总生存期为23.5个月,长于高表达者的10.9个月(P=0.009)。结论LIN28B表达与成人头颈部横纹肌肉瘤肿瘤大小及组织学类型有关。LIB28B可能与成人头颈部横纹肌肉瘤的发生、发展有关,并且其高表达提示预后不良。

慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者血清FOXO3a、LIN28B水平及其预后价值

目的探究慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)患者血清中叉头框转录因子O亚家族成员3a(FOXO3a)、Lin-28同系物B(LIN28B)表达水平及其对预后的评估价值。方法选取105例AECOPD患者为研究对象(加重组),选取同期收治的COPD稳定期患者60例作为稳定组,同期体检健康者60例作为对照组。检测血清FOXO3a、LIN28B水平;Pearson法分析血清FOXO3a、LIN28B水平相关性;根据加重组患者预后情况分为存活组(n=86)和死亡组(n=19);Logistic回归分析患者预后的影响因素;绘制AECOPD患者预后的受试者工作特征(ROC)曲线。结果对照组、稳定组及加重组白细胞计数(WBC)、血清降钙素原(PCT)、血清FOXO3a和LIN28B水平依次升高(P<0.05)。血清FOXO3a与LIN28B表达水平呈现正相关(r=0.548,P<0.05)。多因素Logistic回归分析发现FOXO3a和LIN28B是影响AECOPD的独立危险因素。血清FOXO3a、LIN28B、联合预测AECOPD患者预后的AUC分别是0.922、0.799和0.942;灵敏度分别为94.74%、84.21%和94.74%;特异性分别为84.88%、65.12%和86.05%;二者联合优于血清LIN28B和FOXO3a单独预测(Z_(联合-LIN28B)=2.321,Z_(联合-FOXO3a)=2.874;P均<0.05)。结论AECOPD患者血清FOXO3a、LIN28B水平显著高于稳定组和对照组,可有效预测AECOPD患者预后状况。

miR-125a对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响及机制

目的探讨微小RNA-125a(miR-125a)对子宫内膜癌(EC)细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭等生物学行为的影响及机制。方法常规培养人EC细胞(JEC、HEC-1B、Ishikawa细胞)和子宫内膜上皮细胞(ECS细胞)。用RT-PCR法检测细胞中miR-125a表达,筛选miR-125a表达最低的细胞为实验细胞。取对数生长期miR-125a表达最低的EC细胞,并将其随机分为miR-NC组、miR-125a mimics组,分别转染miRNA阴性对照miR-NC、miR-125a模拟物miR-125a mimics。用RT-PCR法检测miR-125a表达,用CCK-8实验检测细胞增殖活性(OD值),用平板克隆实验检测细胞集落形成能力,用流式细胞术检测细胞凋亡能力(凋亡率),用Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力,Western blotting法检测细胞内LIN28同系物B(LIN28B)蛋白表达。结果与ECS细胞比较,JEC、HEC-1B、Ishikawa细胞中miR-125a相对表达量均低(P均<0.05),且Ishikawa细胞miR-125a的相对表达量最低,将其作为实验细胞。与miR-NC组比较,miR-125a mimics组miR-125a表达高(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-125a mimics组培养24、48、72 h后OD值低,集落形成数少,凋亡率高,迁移细胞数、侵袭细胞数少,LIN28B蛋白相对表达量低,比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论上调miR-125a表达可抑制EC细胞增殖、迁移及侵袭,并诱导其凋亡,该作用可能与其靶向调控LIN28B表达有关。

LIN28A在GT1-7细胞中过表达对性发育相关基因的影响

[目的]在GT1-7细胞过表达LIN28A,研究其与性发育相关基因表达是否存在调控关系; RNA-seq发现LIN28A参与调控性发育的信号通路和基因。[方法]构建LIN28A慢病毒过表达载体,转染GT1-7细胞,Real-Time PCR检测LIN28A和性发育相关基因在mRNA水平表达变化;将过表达LIN28A的GT1-7细胞进行RNA-seq、生物信息学分析、Real-Time PCR验证,找到影响性发育的信号通路和基因。[结果]与对照相比,LIN28A在GT1-7细胞过表达18倍(P <0. 001),KISS1在mRNA水平显著升高(P <0. 01); KEGG分析,LIN28A相关的差异基因在MAPK信号通路差异显著,MAPK通路筛选到多个性发育相关基因(Fgf21、JUN、Cyp1a1、Rasgrp2),Real-Time PCR验证它们在mRNA水平差异显著(P <0. 05)。[结论]成功构建LIN28A慢病毒过表达载体,LIN28A在GT1-7细胞中过表达会促进KISS1的表达,并且LIN28A可能通过MAPK通路调控性发育。

Lin28在浸润性乳腺癌中的表达及临床意义

目的通过免疫病理分析Lin28在浸润性乳腺癌中的表达情况,探讨其与浸润性乳腺癌发生、发展和转移的相关性。方法选取2012年1月-2014年3月无锡市妇幼保健院病理明确诊断的浸润性乳腺癌患者94例(研究组)和乳腺腺病患者45例(对照组)为研究对象,采用免疫组化法检测Lin28、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体-2蛋白(HER-2)的表达水平。HER-2结果附加荧光原位杂交(FISH)确诊。结果 Lin28在对照组中不表达,在研究组中阳性率为15.9%,Lin28主要表达于HER-2阳性或ER、PR和HER-2三阴性乳腺癌中。Lin28在ER阴性的乳腺癌中的表达高于ER阳性的乳腺癌,差异有统计学意义(P<0.05);Lin28在PR阴性与阳性的乳腺癌间的表达差异无统计学意义(P>0.05)。Lin28在淋巴结转移的乳腺癌中的表达高于淋巴结未转移的乳腺癌,差异有统计学意义(P<0.05)。Lin28的表达水平与年龄无关,但高表达于病理分级为Ⅲ级或临床分期为Ⅲ-Ⅳ期的患者组织中,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 Lin28有可能促进浸润性乳腺癌的增殖和侵袭能力。Lin28有可能作为乳腺癌,特别是三阴恶性乳腺癌的一种新型标志物。

索拉菲尼对骨肉瘤细胞的抑制作用及分子机制研究

目的研究索拉菲尼对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的作用及其分子机制。方法将人骨肉瘤细胞(HOS细胞)分为对照组及索拉菲尼组,用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐比色法观察索拉菲尼对HOS细胞活力的影响,用蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白变化,用Real-time PCR检测let-7d变化情况。结果索拉菲尼可抑制HOS细胞活力,并呈剂量和浓度依赖性;同时,索拉菲尼可以抑制Lin28表达,同时促进let-7d表达;过表达Lin28可以逆转索拉菲尼的促凋亡作用。结论索拉菲尼通过调控Lin28/le-7d环路来促进骨肉瘤细胞凋亡。