剑尾鱼卵黄蛋白原的ELISA检测

以卵黄脂磷蛋白（lipovitellin,Lv）抗血清为抗体,以纯化的卵黄蛋白原（vitellogenin,Vtg）为抗原,建立了间接酶联免疫吸附反应（ELISA）方法检测剑尾鱼（Xiphophorus helleri）雄鱼整体匀浆液中ρ（Vtg）.结果表明,该方法的检测灵敏度为7.8 ng/mL,批内变异系数为5.094%,批间变异系数为5.540%,工作范围为32.5～2 000 ng/mL,在该范围内,标准曲线具有良好的线性和重复性.由于该方法可直接在1块或在不同的酶标板上准确地进行比较,因而可利用ELISA方法测定经诱导雄鱼整体匀浆液中ρ（Vtg）水平.结果显示,50μg/L 17-β雌二醇（E2）诱导21 d的雄性剑尾鱼有明显的Vtg产生;10μg/L E2诱导剑尾鱼亦有Vtg产生,但较50μg/L E2诱导组低;1μg/L E2诱导组及对照组剑尾鱼没有Vtg产生,检测孔OD450/对照OD450（P/N）值小于2.1.

剑尾鱼卵黄脂磷蛋白的纯化及免疫分析

采用Sephacryl S-300凝胶过滤层析柱和HiTrap Q阴离子交换柱从卵黄生成期的雌性剑尾鱼（Xiphophorus helleri）卵巢组织提纯了卵黄脂磷蛋白（Lv）。已确定被纯化的剑尾鱼Lv在Native-PAGE（4％～7．5％）电泳中分子量为530kD左右。Native-PAGE（4％～7．5％）电泳后的凝胶分别进行糖蛋白染色、脂蛋白染色及磷蛋白染色。结果表明，剑尾鱼Lv是一种富含糖、脂、磷的蛋白。用纯化的剑尾鱼Lv免疫大白鼠获得鼠源多克隆抗血清。用免疫双扩散的方法测定Lv抗血清的效价为1：32。Western-blotting检测显示抗血清的特异性较好；卵黄蛋白原（Vtg）和Lv抗血清之间存在明显的免疫交叉反应，表明Vtg和Lv两者具有相同的免疫原性。免疫双扩散检测表明，抗Lv血清表现出明显的雌性特异性和种的特异性。

瓦氏黄颡鱼卵黄脂磷蛋白(Lv)的纯化、性质鉴定及其抗血清的研制

采用凝胶过滤和离子交换两种层析技术,从瓦氏黄颡鱼Ⅳ期卵巢粗提液中分离、纯化出卵黄脂磷蛋白(Lv),采用糖、磷、脂蛋白染色技术验证分离、纯化的蛋白为Lv,该Lv在非变性条件下分子量约为230ku,在SDS变性条件下分子量约为106ku。纯化的瓦氏黄颡鱼Lv经检测显示含有类胡萝卜素,但没有二硫键,对热相对稳定。利用纯化的瓦氏黄颡鱼Lv,制备了兔抗瓦氏黄颡鱼Lv多克隆抗血清。通过双向免疫扩散法测得Lv抗血清的效价为1∶32,还发现瓦氏黄颡鱼卵黄蛋白原(Vtg)和Lv之间有明显的免疫交叉反应性,说明两者具有相同的免疫原性;Western-blotting检测显示抗血清的特异性较好,并能特异性地识别Vtg。

唐鱼卵黄脂磷蛋白的纯化鉴定与免疫原性分析

采用Native-PAGE和SDS-PAGE方法从性成熟雌性唐鱼（Tanichthys albonubes）卵巢组织提纯了卵黄脂磷蛋白（Lv）．已确定被纯化的唐鱼Lv在Native-PAGE（4％～7．5％）电泳中分子量（Mr）为314×10^3．用纯化的唐鱼Lv免疫大白鼠获得鼠源多克隆抗血清．以Native-PAGE和SDS-PAGE制备的唐鱼Lv及裂解后的组分作为抗原所制备的抗血清，与经17β-雌二醇（E2）诱导的雄性唐鱼、去除卵巢的雌性唐鱼以及唐鱼卵巢的匀浆液能发生免疫反应，并且印迹位置与雌性特异蛋白卵黄蛋白原（Vtg）的位置相当．但是两种血清和未经E2诱导的雄鱼整体匀浆液并无反应，显示Lv及其大分子亚基的抗血清与Vtg和Lv两种蛋白足特异的．结果表明，唐鱼Lv裂解组分的抗血清可用于检测唐鱼的Vtg．

不同pH下硫化物胁迫对中华绒螯蟹亲体卵巢发育的影响

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)亲体初始体质量为(80.228±6.270)g。实验采用2×3因子设计,设置pH 6.5条件下的3个硫化物浓度组LS1(0.1 mg/L)、MS1(0.33 mg/L)和HS1(1.0 mg/L),以及pH 8.5下的3个硫化物浓度组LS2(0.1 mg/L)、MS2(0.33 mg/L)和HS2(1.0 mg/L),共6个处理组;另设一个不添加硫化物的对照组CTR(自然pH值为7.5),设2个平行处理,分别在实验后第10天、20天和30天取样,以性腺指数(GSI)、卵巢卵黄磷蛋白(Lv)含量、卵巢Lv总含量和卵巢蛋白质含量的变化为评判指标,研究了硫化物胁迫对中华绒螯蟹亲体卵巢发育的影响。结果表明,不同pH条件下各处理组的GSI在30 d时均低于对照组,其中HS组显著低于对照组(P<0.05)。在各取样时间点,所有处理组蟹卵巢的Lv含量均低于对照组,且MS和HS组在前20 d显著低于对照组(P<0.05),但这种差异随时间的推移而逐渐减小;至暴露结束时仅HS1组蟹的卵巢Lv含量显著低于对照组(P<0.05)。各处理组蟹的卵巢Lv总含量始终低于对照组,且这种差异随时间的推移而逐渐增大;第10天时仅HS1组的Lv总量显著降低,而时间延长至30 d后,各处理组Lv总量均显著低于对照组(P<0.05)。结论认为,慢性硫化物胁迫会抑制中华绒螯蟹雌体的卵巢发育,相比之下,弱酸条件下水体中硫化物的毒性作用有所增强。

哲罗鲑生殖周期中血清卵黄蛋白原浓度的ELISA检测

采用柱层析、蛋白免疫印迹和电泳等方法对哲罗鲑（Hucho taimen）的卵黄脂磷蛋白进行研究，并以其鼠抗和兔抗血清为抗体建立了夹心酶联免疫反应（ELISA）对生殖周期中哲罗鲑血清卵黄蛋白原浓度的变化进行检测。结果表明，哲罗鲑卵黄脂磷蛋白分子量在460ku，并且由3个亚基组成，分子量分别为137．8ku、84．2ku和10．8ku。蛋白免疫印迹表明，卵黄脂磷蛋白抗血清与雄鱼血清无特异性反应，而与雌鱼血清有特异的反应。本研究建立的双抗体夹心ELISA检测灵敏度为7．8ng／mL，批内变异系数为4．06％，批间变异系数为4．58％，工作范围为30～2000ng／mL，在该范围内标准曲线具有良好的线性和重复性。生殖周期中哲罗鲑血清卵黄蛋白原浓度由每年6月份产孵后的最低值573．4ng／mL升高到12月份的最高值1918．2ng／mL，卵黄积累持续期为6个月，整个生殖周期中血清卵黄蛋白原浓度只出现一个高峰期，表明人工养殖条件下，性成熟哲罗鲑的生殖周期为1年。

黑龙江茴鱼卵黄脂磷蛋白分离纯化及抗血清的研制

采用SephadexG-200凝胶过滤层析法,对黑龙江茴鱼卵黄蛋白粗提液进行分离纯化,层析洗脱共得到3个蛋白峰。用聚丙烯凝胶电泳、免疫扩散等方法研究表明:黑龙江茴鱼卵黄蛋白(Yolk protein)含有分子量分别为567.2,486.3,157.5 kDa的3种蛋白,由分子量分别为80.7,68.7,46.8,39,30,20.9,16.7,14.9,14.1 kDa的9个蛋白亚基组成;峰2蛋白为卵黄脂磷蛋白(Lipovitellin,Lv),分子量为486.3 kDa,由分子量为80.7,30,14.9,14.1 kDa的4个蛋白亚基组成;纯化的黑龙江茴鱼Lv免疫新西兰大白兔获得兔源多克隆抗血清,用免疫扩散的方法测定Lv抗血清效价为1∶64;免疫双扩散检测表明,抗Lv血清表现出明显的雌性特异性。

大阪鲫鱼两种卵黄蛋白免疫细胞化学的研究

以电泳提纯的卵黄脂磷蛋白和卵黄蛋白Ｌ制备兔抗两种蛋白的抗血清。采用ＰＡＰ法对性腺成熟雌性大阪鲫鱼的肝细胞和卵母细胞进行两种蛋白免疫细胞化学定位研究。肝细胞的粗面内质网上有强烈的卵黄脂磷蛋白的阳性反应，特别是在线粒体的基质中也发现卵黄脂磷蛋白的阳性反应。而另外一种类似于卵黄高磷蛋白的卵黄蛋白──卵黄蛋白Ｌ在肝细胞的粗面内质网和线粒体均呈现阴性反应。提示卵黄脂磷蛋白的前体物质存在于肝细胞的粗面内质网和线粒体中，而卵黄蛋白Ｌ则不是来源于肝细胞。卵母细胞的卵黄颗粒上两种蛋白均呈现阳性反应。卵母细胞外的滤泡细胞也存在卵黄脂磷蛋白的阳性反应。透明带和卵母细胞表面的凹陷中存在卵黄脂磷蛋白的阳性反应颗粒物质，并发现大量纤维状物质存在于透明带和卵母细胞表面。这揭示卵黄脂磷蛋白的前体物质可能首先进入滤泡细胞，分解后经透明带被卵母细胞吞噬摄入，并与卵黄蛋白Ｌ共同存在于卵黄颗粒上。

唐鱼卵黄蛋白原的ELISA检测方法的建立

目的探索建立唐鱼卵黄蛋白原的ELISA检测方法。方法以卵黄脂磷蛋白(Lv)抗血清为抗体,以纯化的Lv作为抗原建立间接酶联免疫吸附反应(ELISA)方法检测雄性唐鱼(Tanichthys albonubes)整体匀浆液中的卵黄蛋白原(Vtg)。结果利用ELISA方法测定了经17-β雌二醇(E2)和不同浓度DDTs暴露21 d诱导的雄鱼整体匀浆液中的Vtg含量,可以直接在1块或在不同的酶标板上准确地进行比较。经0.055 mg/mL E2诱导的雄鱼整体匀浆液中Vtg含量为4148.33μg/g;当暴露DDTs浓度为0.0275、0.0137和0.0067 mg/mL时,雄鱼整体匀浆液中Vtg含量分别为1109.43、911.16和1322.79μg/g,与丙酮溶剂对照组462.79μg/g比较差异存在显著性(P<0.05)。结论建立了唐鱼卵黄蛋白原的ELISA检测方法 ,本方法的检测灵敏度为8.1 ng/mL,批内误差为8.59%,批间误差为6.28%,工作范围为3.26～209.25 ng/mL。在该范围内,标准曲线具有良好的线性和重复性。

施氏鲟卵黄蛋白原及其相关蛋白的研究

采用凝胶柱层析、聚丙烯凝胶电泳、免疫印迹(Western blotting)和免疫扩散等方法对施氏鲟卵黄蛋白原(Vi-tellogenin,Vg)及其相关蛋白(Yolk protein,YP)进行了研究。结果表明,施氏鲟血清Vg是一种糖脂磷蛋白,其相对分子量为410kD,由分子量为205kD的两个同源亚基组成。Vg的3种相关蛋白YP1、YP2和YP3。其中YP1相对分子量为370kD,是一种糖脂磷蛋白,由相对分子量为97kD和33kD的两个亚基构成。YP2是一种相对分子量为144kD的磷脂蛋白,由相对分子量为94kD和45kD的2个亚基构成。YP3为相对分子量为66kD的磷蛋白,由相对分子量为30kD的同源亚基构成。

中华鲟卵黄脂磷蛋白的分离纯化及性质分析

采用Sephacryl S-300凝胶过滤和DEAE Fast Flow阴离子交换两种层析法分离纯化中华鲟(Acipenser sinensis)卵黄脂磷蛋白(lipovitellin,Lv),对每个峰进行SDS-PAGE电泳及油红O、甲基绿和Schiff试剂特异染色,峰Ⅱ蛋白均呈阳性,表明峰Ⅱ蛋白为中华鲟卵中的一种卵黄脂磷蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明其由一种分子质量为43.5 ku的亚基构成。对中华鲟Lv氨基酸组成进行研究,证明其是一种含有相对较多天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸和亮氨酸的蛋白。

大阪鲫鱼两种卵黄蛋白紫外吸收特性的研究

采用大柱制备电泳的方法从大阪鲫鱼卵巢中提纯出两种蛋白质:卵黄脂磷蛋白和类似于卵黄高磷蛋白的卵黄蛋白L.分析了两种蛋白的氨基酸组成,并对两种蛋白的紫外吸收和紫外吸收四阶导数谱特性进行了分析研究。发现卵黄脂磷蛋白在溶液的pH改变(pH3.12-8.12-11.00)时,紫外吸收谱和四阶导数谱未发生明显变化,而卵黄蛋白L在溶液的pH改变(pH7.66-9.35-11.89)时,其紫外吸收谱最大吸收波长红移,紫外吸收四阶导数谱出现新的未知峰,发生显著变化。这表明卵黄脂磷蛋白所含的大量脂类存在于蛋白质分子的表面,从而影响了蛋白质分子中产生紫外吸收的氨基酸—酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸的紫外吸收。在卵黄蛋白L中,这几种氨基酸则位于蛋白质分子的表面,从而对溶液pH的变化尤为敏感。

鱼类卵黄蛋白的研究进展

卵黄蛋白为鱼类早期的胚胎发生和发育提供营养物质并发挥生物功能,鱼类卵黄蛋白原和卵黄脂磷蛋白可作为检测环境中雌激素的生物标志物。系统介绍卵黄蛋白的前体卵黄蛋白原的发生、鱼类卵黄蛋白的主要成分卵黄脂磷蛋白和卵黄高磷蛋白的结构以及鱼类卵黄蛋白生理功能的研究进展,并进行展望。

河川沙塘鳢Odontobutis potamophila(Günther)卵黄蛋白原(Vtg)和卵黄脂磷蛋白(LV)生化特性的比较

通过分离纯化河川沙塘鳢Odontobutis potamoph ila(Günther)卵黄蛋白原(Vtg)和卵黄脂磷蛋白(LV)并用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)确定其分子量,SDS-PAGE分析其亚基组成。结果显示卵黄蛋白原分子量为556.5kD,卵黄蛋白分子量为440kD。卵黄蛋白由6个亚基组成,分子量分别为:120、110、100、97.25、41.18、31.30 kD。卵黄蛋白原由5个亚基组成,分子量分别为:140 120 110 100 97.25kD。

大阪鲫两种卵巢蛋白的纯化及其生化特性

应用制备电泳技术，从大阪鲫（ＣａｒａｓｓｉｕｓａｕｒａｔｕｓＣｕｖｉｅｒ）卵匀浆液中提纯两种卵黄蛋白—蛋白质Ｈ及蛋白质Ｌ。蛋白质Ｈ类似卵黄脂磷蛋白（磷为０．２４％，氮为９．１８％，等电点６．７４），分子量４７１０００。在ＳＤＳ电泳中显示４条带，分子量分别为９５８００、９０７００、８６５００、２６９００。蛋白质Ｌ是类卵黄高磷蛋白，其分子量为９４０００。在ＳＤＳ电泳中显示一条带（含磷８．８５％、氰１４．１４％，等电点７．０１），分子量２９４００。同时也观察到在不同ｐＨ值溶液中两种蛋白质紫外光吸收光谱和四阶导数谱变化的现象。

尼罗罗非鱼卵黄脂磷蛋白的分离纯化与性质鉴定

采用Sephacryl S-300过滤层析和DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析相结合的方法从尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)成熟卵子匀浆液中分离纯化出了一种高分子量的蛋白。该蛋白能被Schiff试剂、甲基绿和苏丹黑B着色,Western blot显示能被金鱼卵黄脂磷蛋白(lipovitellin,Lv)多克隆抗血清特异性识别,在非变性条件下分子量约为560 k D,在SDS变性条件下分子量约为112 k D,结果表明分离纯化的蛋白是一种含有糖、磷、脂基团的蛋白,符合鱼类Lv的性质,且与金鱼Lv有免疫交叉反应,从蛋白的性质和免疫原性以及分子量大小等角度判断,本研究获得的高纯度蛋白为尼罗罗非鱼卵黄脂磷蛋白;纯化的罗非鱼Lv在反复冻融、37℃及60℃处理条件下均未出现降解,表明罗非鱼Lv比鱼类卵黄原蛋白(Vitellogenin,Vtg)更为稳定。研究结果为罗非鱼Lv抗体的制备奠定了基础。

鲫卵黄脂磷蛋白的纯化鉴定及其夹心ELISA的建立

鲫(Carassius carassius)卵黄原蛋白(vitellogenin,Vtg)是检测水体环境雌激素活性常用的生物标志物。本研究利用凝胶过滤结合离子交换层析与选择性沉淀结合离子交换层析2种方法,从鲫卵巢匀浆液中纯化得到了卵黄脂磷蛋白(lipovitellin,Lv),经鉴定该蛋白含有糖、磷、脂基团,天然分子量约为521 kD,SDS变性电泳显示分子量为117 kD和103 kD的2个亚基。Western blot结果显示,金鱼(Carassius auratus)Lv抗体和斑马鱼(Danio rerio)Lv抗体都能与鲫Lv发生很好的交叉反应。利用纯化的鲫Lv与金鱼Lv抗体和斑马鱼Lv抗体建立了2种夹心ELISA,发现金鱼Lv和鲫Lv的结合曲线基本重合,并且利用鲫Lv与金鱼Lv抗体建立的夹心ELISA工作范围为15.6~1000 ng/mL,检出限约为6.8 ng/mL,显著低于利用斑马鱼Lv抗体建立的夹心ELISA,结合此前研究者建立的鲫Vtg竞争ELISA,为鲫Vtg指标的测定提供了可靠方法。

卵黄蛋白的结构和功能

卵黄蛋白是卵生动物胚胎发育和早期幼体发育的主要营养物质,主要组分为卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vg)酶解产生的卵黄脂磷蛋白(Lipovitellin,Lv)和卵黄高磷蛋白(Phosvitin,Pv).近年来,对于Lv和Pv结构和功能的研究取得长足进展,特别是发现它们具有免疫功能,使我们对Lv和Pv的作用有了新的认识.本文从结构、属性和功能方面对Lv和Pv进行了系统概述.

斑马鱼卵黄脂磷蛋白在早期胚胎中促进L1-ORF2诱导的EGFP报告基因表达

为了探讨长散布核元件-1(long interspersed nuclear element-1,L1)在胚胎早期高表达的分子机制,将人L1的第二个开放阅读框(open reading frame 2,ORF2)(L1-ORF2,该文中简称ORF2),插入到pEGFP-C1质粒(C1)的EGFP基因下游,生成C1-ORF2表达载体,插入的ORF2可以影响EGFP报告基因的表达。将C1-ORF2等表达载体注射到斑马鱼(Danio rerio)早期胚胎中,结果表明,在所使用的表达载体中,只有插入ORF2的表达载体诱导EGFP报告基因高表达。C1-ORF2表达载体诱导的EGFP荧光强度随着胚胎的发育而显著降低。EGFP荧光报告蛋白在C1-ORF2中的表达受到组蛋白的抑制,0 h胚胎溶卵液(简称胚胎溶卵液)能减弱组蛋白对EGFP表达的抑制作用,从胚胎溶卵液中纯化的卵黄脂磷蛋白(lipovitellin,Lv)的作用强于胚胎溶卵液。凝胶阻滞实验表明,ORF2 DNA能与胚胎溶卵液蛋白、组蛋白和Lv结合。改变组蛋白、Lv和ORF2片段三者的添加顺序,结果证明Lv可以结合ORF2片段和组蛋白,从而干扰组蛋白与ORF2的结合。进一步研究发现,Lv增加了C1-ORF2 DNA对DNase I消化的敏感性。该研究获得以下结论:Lv可以与所有检测的DNA片段结合,但与ORF2的结合比与其他DNA片段的结合亲和力更高。Lv通过提高ORF2 DNA染色质的易接近性,激活ORF2诱导的斑马鱼早期胚胎EGFP基因的表达。

卵黄脂磷蛋白通过网格蛋白介导的内吞作用进入培养的人成纤维细胞

为了探究从斑马鱼(Danio rerio)胚胎裂解液中纯化的卵黄脂磷蛋白(lipovitellin,Lv)进入培养的人成纤维细胞的分子途径,该研究用Sephadex G-200色谱柱结合QAE-Sephadex A50阴离子交换色谱柱从斑马鱼0 h胚胎裂解液中分离纯化出Lv。FITC标记的Lv(FITC-Lv)预先分别与Hepes、牛组蛋白、鱼精蛋白、卵磷脂、0 h胚胎胰蛋白酶水解物或者斑马鱼胚胎裂解液孵育,再加入至opti-MEM培养基中培养人成纤维细胞,培养一定时间后,用荧光倒置显微镜观察,发现Hepes和组蛋白可以促进Lv进入细胞。制霉菌素是陷窝介导的内吞作用(caveolae-mediated endocytosis)的抑制剂,氯丙嗪和蔗糖是网格蛋白介导的内吞作用(clathrin-mediated endocytosis)的抑制剂,阿米洛利是巨胞饮作用(macropinocytosis)的抑制剂。为了证实Lv进入细胞的分子途径,在FITC标记Lv与人成纤维细胞的培养体系中,分别加入上述抑制剂。结果发现氯丙嗪和蔗糖可以抑制Lv进入细胞。该研究获得如下结论:纯化的斑马鱼Lv单独不能进入细胞,在组蛋白的协同作用下,Lv通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞。该研究将为进一步研究Lv进入细胞发挥生物学功能奠定基础。