Lipstatin高产菌株筛选

以毒三素链霉菌XC-lp-2的变株OT-3为出发菌株,经UV和微波复合诱变处理,并在含豆油的平板上定向筛选耐豆油突变株,获得了高产突变株XC-lp-69,其lipstatin发酵效价达到911μg/ml,较出发菌株OT-3提高了71.6%。传代试验表明突变株XC-lp-69的高产遗传特性稳定。

Lipstatin生产菌株发酵动力学研究

对Lipstatin生产菌株——毒三素链霉菌发酵动力学特性进行了研究,提出了细胞生长动力学、基质消耗动力学、产物生成动力学模型,得到了描述该发酵过程的菌体生长动力学方程、基质消耗动力学方程、产物生成动力学方程。采用Origin软件,对实验数据与模型进行了拟合,拟合度良好,三个模型的线性相关性R值均在0·988以上。

亚油酸对Lipstatin发酵生产的影响研究

亚油酸作为一种前体物质,对Lipstatin的生物合成有重要的影响。通过研究发酵培养基中亚油酸浓度对毒三素链霉菌发酵的影响,表明合适的亚油酸浓度能显著促进Lipstatin的生物合成。在此基础上,进一步研究了不同补料时间和补料速率对毒三素链霉菌发酵生产Lipstatin的影响,最终确定了最佳的补料时间和补料速率。在亚油酸浓度为20g·L-1的发酵培养基中,接种后发酵36h时开始补料、补料速率为0.35g·L-1.h-1时,Lipstatin的发酵效价最高,为6.8g·L-1。

脂肪酶抑制剂Lipstatin的发酵罐发酵工艺优化

研究了溶氧和剪切力对毒三素链霉菌(Streptomyces tocytricini)发酵产生Lipstatin的影响,并对Lipstatin发酵从摇瓶到10 L发酵罐的放大及补料工艺进行了研究。根据Lipstatin菌株发酵溶氧要求高、对剪切力敏感的特性及高油培养基质地黏稠的特点,优化了Lipstatin 10 L全自动发酵罐的搅拌工艺、通气量并建立合适的补料工艺,改善Lipstatin发酵过程中的溶氧水平。Lipstatin 10 L发酵罐发酵效价达到6 446μg/mL,比摇瓶发酵效价提高约40%,发酵周期缩短1 d。

lipstatin发酵工艺的优化

目的优化lipstatin的发酵工艺。方法采用摇瓶发酵,改变实验条件,通过测定lipstatin含量来确定较为适合的发酵工艺。结果优化后的培养基组成为:豆油8.0%,甘油0.7%,黄豆粉3.0%,酵母粉1.0%,TritonX-100 0.1%。在此条件下lipstatin发酵产量为156.8 mg/L。结论提高了lipstatin产量。

响应面法优化毒三素链霉菌FIM-17-16产Lipstatin发酵培养基

[目的]为提高Lipstatin产量,对其产生菌毒三素链霉菌FIM-17-16的发酵培养基组成进行优化。[方法]通过单因素实验考察亮氨酸对Lipstatin产量的影响,在此基础上,通过Plackett-Burman设计从9个因素中筛选显著影响Lipstatin产量的因素,最后利用中心组合(central composite)设计与响应面分析法确定Lipstatin的最佳培养基,并分析关键因素之间的交互作用。[结果]在发酵72 h添加4 g/L的亮氨酸,可促进Lipstatin合成。经Plackett-Burman设计确定对Lipstatin产量影响有显著作用的了4个因素为卵磷脂、甘油、亮氨酸和初始p H。最后以Central Composite设计建立上述4个关键因子对Lipstatin产量的数学模型,获得最佳发酵培养基组合为:卵磷脂12 g/L、甘油22 g/L、亮氨酸4 g/L和p H 6.5。经上述培养基优化,毒三素链霉菌FIM-17-16产Lipstatin由优化前的9 571 mg/L提高至12276 mg/L。[结论]经优化后的发酵培养基可有效提高Lipstatin产量,为其工业化生产奠定基础。

奥利司他及其中间体的合成研究进展

奥利司他给肥胖病的治疗带来了新的途径,其化学全合成方法是当下的研究热点。综述了奥利司他的化学全合成工艺,奥利司他的合成工艺有以月桂醛、不饱和脂肪酸甲酯以及1,3,5-环己三醇以等为原料的合成路线,其中尤以月桂醛法最受关注,月桂醛由于碳链较长,可以直接进行缩合,大幅度缩短了反应路线,并且该法具有收率较高、原料便宜易得以及操作条件简单的优势,已经开始被国内部分厂家采用,有良好的市场前景,有望取代目前常用的天然Lipstatin还原法。

利普司他汀发酵工艺研究

以毒三素链霉菌(stretomyces toxytricini)突变株XC-lp-69为试验菌株,研究了利普司他汀(lipstatin)的发酵工艺.通过单因素条件试验确定了其生物合成的最适温度,种龄,接种量及摇瓶装量.以正交试验优化了其发酵培养基,并进行了发酵中间补料试验,确定了最佳补料工艺.试验结果表明:以5.5%豆油,2.0%甘油,3.0%黄豆粉,1.0%酵母粉,1.2%卵磷脂的发酵培养基配方,以20h种龄,接种量2.0%,在250 mL三角瓶中装量25 mL,27℃下发酵,在发酵46 h时补加豆油/甘油混合物,利普司他汀的发酵效价达1 400μg.mL-1.

毒三素链霉菌发酵产物中有关物质的结构鉴定

目的对由毒三素链霉菌发酵法生产Lipstatin时所产生的有关物质进行结构鉴定。方法使用制备型HPLC法分离,用波谱法进行结构鉴定。结果该有关物质被鉴定为:[二(2-乙基-己酯)]-邻苯二甲酸。结论该化合物与Lipstatin无直接关联,它是一种常用的增塑剂,可能是生产过程中的污染物。

低能N^+注入选育利普司他汀高产菌株的研究

利用N^+注入技术对出发菌株Stretomyces toxytricini NJLE202进行诱变选育,考察20keV能量下不同剂量N^+注入对菌株存活率和正负突变率的影响。最佳注入剂量下对出发菌株经过多轮诱变选育,筛选得到1株利普司他汀高产菌株C-1-34,较出发菌株效价提高了约33.7%,且遗传稳定性良好。

大孔树脂分离纯化利普司他汀

以吸附量、解吸率、洗脱流速等为考查指标,确定AB-8型大孔树脂分离纯化利普司他汀的最佳工艺为:层析柱中静止吸附的时间为1.0 h,上柱液质量浓度为12 mg/g,最佳上样量为20 mL,洗脱流速为5 mL/min,洗脱溶剂为30%A溶剂(60%甲醇与0.2%NaCl)和70%B溶剂(0.006 mol/L的HCl,80%甲醇);在此条件下利普司他汀的相对含量可达到96.79%。

利普司他汀粗品的提取工艺优化

采用乙醇超声浸提法从毒三素链霉菌发酵液中提取利普司他汀,再经萃取、乙腈冷冻除油处理,得到利普司他汀粗品。确定最佳浸提条件为:超声时间30 min,乙醇体积分数80%;最佳萃取条件为:以正庚烷为萃取剂,浸提液与正庚烷体积比3∶1,萃取温度80℃。在此条件下,利普司他汀纯度及回收率均较高。采用乙腈冷冻除油工艺代替大孔树脂吸附工艺脱脂,减少了溶剂浪费,降低了生产成本,且操作简便,更适合工业化生产。

硅胶柱层析纯化利普司他汀工艺研究

采用硅胶柱层析法对利普司他汀粗品进行分离纯化,确定最佳纯化工艺条件如下:以120目硅胶为固定相,依次用1 BV 5%丙酮-正庚烷、1 BV 10%丙酮-正庚烷、7 BV 15%丙酮-正庚烷、2 BV 30%丙酮-正庚烷梯度洗脱,洗脱流速为0.75 BV·h^(-1),载样量为3%,收集7 BV 15%丙酮-正庚烷的洗脱液。在此条件下,利普司他汀纯度可达80.499%。该工艺除杂效果明显,有利于后续工序分离纯化得到高纯度的利普司他汀。

产利普斯他汀菌株Streptomyces toxytricini FIM-17-16发酵条件的优化

目的Streptomyces toxytricini FIM-17-16菌株生物合成利普斯他汀发酵条件的优化。方法采用单因素试验和正交设计实验相结合的方法,优化Streptomyces toxytricini FIM-17-16发酵培养基和发酵参数。结果确定了适宜发酵培养基配方和发酵参数:葵花籽油7%,甘油2%,黄豆粉3.25%,麸皮1%,卵磷脂1%,硫酸锌0.01%,碳酸钙0.08%,初始pH自然,装料系数80mL/500mL,种龄20h,接种量15%,摇床转速230r/min,发酵温度28℃,发酵时间168h,产利普斯他汀的水平达到了9667μg/mL,提高了20.6%,发酵周期缩短24h。结论经过优化发酵条件,S.toxytricini FIM-17-16生物合成利普斯他汀能力大幅提高,为该菌株的工业化生产奠定了基础。

响应面法优化毒三素链霉菌中利普司他汀的提取工艺

采用响应面法对毒三素链霉菌提取工艺进行优化。首先确立乙醇为最佳的溶剂。以利普司他汀提取收率为指标,以乙醇为浸提溶剂,对料液比、乙醇体积分数、浸提时间、浸提温度和浸提次数进行单因素实验。在此基础上,选取料液比、乙醇体积分数、浸提时间为自变量,采用Box-Behnken设计的方法,研究各自变量及其交互作用对利普司他汀提取收率的影响。结果表明:毒三素链霉菌中利普司他汀的最佳提取工艺条件为液料比6.32∶1 m L/g、乙醇体积分数95%、浸提时间3.61 h。在此条件下,利普司他汀提取收率的预测值为83.35%,实验验证值为84.50%,相对误差为1.36%。

发酵法生产利普司他汀的研究进展

利普司他汀(lipstatin)是一种β-内酯分子,能选择性抑制胰脂肪酶的活性,从而减少小肠脂肪的吸收。分析表明,一个利普司他汀分子与一个脂肪酶分子结合,通过活性部位丝氨酸残基的酰化来抑制胰脂肪酶的催化活性。利普司他汀由毒三链霉菌(Streptomyces toxytricini,简称S.toxytricini)生产的一种天然产物。本文综述了利普司他汀的结构特点,分析了利普司他汀市场应用现状,着重论述了发酵法生产利普司他汀的研究进展;提出生物合成利普司他汀的机制尚不清楚,但酰基辅酶A羧化酶(ACCase)复合物在利普司他汀生物合成中起着关键作用。最后,指出当前存在的问题并对代谢工程在利普司他汀产生菌发酵中的应用进行概述,对今后的研究趋势进行了展望。

利普斯他汀高产菌株毒三素链霉菌AP617-N12CA的全基因组测序与分析

目的解析利普斯他汀(lipstatin)高产菌株毒三素链霉菌AP617-N12CA(S.toxytricini AP617-N12CA)的基因组序列信息,为深入研究该菌株高产lipstatin的分子机理与调控机制奠定基础。方法联合应用三代单分子测序技术和二代高通量测序技术对AP617-N12CA菌株进行全基因组测序,使用相关软件对测序数据进行进基因组组装、基因预测和功能注释,并对lipstatin及其他次级代谢产物生物合成基因簇进行分析预测。结果AP617-N12CA菌株整个基因组大约6.99Mb,GC含量73.76%,含有6134个编码序列;基因组由一条长约6.38Mb的线型染色体和一个长约0.61Mb的线型质粒组成;同时预测得到22个次级代谢产物合成基因簇,其中lipstatin基因簇定位在线型质粒右臂区域而非在染色体上。结论首次完成了AP617-N12CA菌株全基因组完成图绘制,在S.toxytricini菌中首次发现和描述了线型质粒,在线型质粒上定位并鉴定分析了lipstatin基因簇。为S.toxytricini的功能基因组学研究和lipstatin高产机理解析提供了基础数据,对后续相关研究具有重要意义。

一株来自红树林土壤的利普斯他汀产生菌的分离鉴定与发酵特性初步研究

从红树林土壤中筛选到一株产利普斯他汀(Lipstatin)的菌株GWL1.2012,通过形态特征、生理生化及16S rDNA序列分析,对该菌进行鉴定。结果显示,菌株GWL1.2012与毒三素链霉菌形成一个类群,同源性高达99.7%,故将其鉴定为毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini),并对菌株GWL1.2012发酵特性进行初步研究,为以后的产业化开发生产提供参考依据。

利普司他汀的提纯工艺研究

目的研究从毒三素链霉菌的发酵液菌粉中提纯利普司他汀(lipstatin)的新工艺。方法对比不同溶剂对发酵液菌粉的浸提效果,并经脱色、萃取及结晶等步骤纯化。结果乙腈从发酵液菌粉中浸提得到的粗提物中利普司他汀含量最高,达50.7%,比甲醇、乙醇、丙酮的浸提效果高4倍;经纯化得到的利普司他汀含量高达85%。结论此工艺步骤简单,成本低,为制备高纯度奥利司他(orlistat)提供了方便。

利普斯他汀的微填充床连续流动加氢

采用微填充床反应器首次实现了利普斯他汀连续流动加氢合成奥利司他,优化的反应条件为:氢气压力为1 MPa,温度为50℃,溶剂是庚烷,原料浓度是50 mg/mL,氢气/利普斯他汀摩尔比为3∶1,质量空速为0.3 h^(-1),催化剂采用1%Pd/Al_(2)O_(3)。相较于传统高压加氢釜工艺,连续流动加氢工艺节约钯催化剂80%,产率提升5%,同时具有本质安全的特点,更适合现代工业生产。