蛇床子素对肝癌Huh7细胞增殖、凋亡及放射敏感性的影响及机制研究

目的:探讨蛇床子素对人肝癌Huh7细胞增殖、凋亡及放射敏感性的影响,并初步探究其作用机制。方法:采用不同浓度(0,2.5,5,10,20,40μg·ml^-1)的蛇床子素干预人肝癌Huh7细胞,噻唑蓝(MTT)法检测蛇床子素对肝癌Huh7细胞增殖的影响,并计算半数抑制浓度(IC50);10μg·ml^-1蛇床子素联合不同照射剂量(0,2,4,6,8 Gy)的X射线处理Huh7细胞,MTT检测细胞增殖能力,筛选照射剂量;克隆形成实验检测Huh7细胞放射敏感性变化,分别采用10μg·ml^-1蛇床子素、4 GyX射线照射及两者联合干预Huh7细胞,流式细胞术检测Huh7细胞凋亡率,Western Blot检测Huh7细胞中剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)和剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(cleaved caspase-9)的表达水平。结果:蛇床子素对肝癌Huh7细胞增殖有明显抑制作用,IC50为20.14μg·ml^-1;与单纯照射组相比,蛇床子素联合不同剂量X射线照射下均能够明显抑制细胞存活率,筛选出4 Gy剂量用于后续放射实验。与单纯照射组相比,蛇床子素联合照射组Huh7细胞的放射敏感性、Huh7细胞凋亡率、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论:蛇床子素能够抑制肝癌Huh7细胞增殖,促进细胞凋亡,并增强细胞对放射的敏感性,其作用机制可能与蛇床子素上调cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达有关。

环状RNA_0003028靶向微小RNA-498调控生殖器形成抑制基因-1/p53信号通路对人肝癌细胞系Huh7的影响

目的探讨环状RNA(circ)_0003028对人肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及分子机制。方法人肝癌细胞系Huh7分为小干扰RNA(si)-NC组、si-circ_0003028组、微小RNA(miR)-NC组、miR-498模似物(mimics)组、si-circ_0003028+anti-miR-NC组、si-circ_0003028+anti-miR-498组;Real-time PCR检测肝癌组织及各组细胞中circ_0003028和miR-498表达水平;MTT检测细胞增殖;Transwell检测细胞迁移和侵袭数;Western blotting检测蛋白表达;双荧光素酶报告实验检测circ_0003028和miR-498的靶向调控关系。结果肝癌组织中circ_0003028表达水平升高(0.98±0.02 vs 1.36±0.01),miR-498表达水平降低(0.98±0.02 vs 0.63±0.02)(P<0.05)。抑制circ_0003028表达或miR-498过表达后,Huh7细胞中Ki-67(0.85±0.02 vs 0.41±0.02或0.95±0.11 vs 0.37±0.02)、基质金属蛋白酶(MMP)-2(0.71±0.02 vs 0.43±0.03或0.83±0.02 vs 0.41±0.03)、MMP-9(0.74±0.02 vs 0.37±0.02或0.78±0.02 vs 0.39±0.02)蛋白表达水平降低,细胞活性(1.53±0.03 vs 1.05±0.02或1.68±0.02 vs 1.11±0.02)降低;迁移(111.40±2.12 vs 77.22±2.38或108.90±2.30 vs 78.44±1.46)和侵袭(87.89±2.18 vs 49.78±1.98或80.22±1.79 vs 38.22±1.52)细胞数减少,生殖器形成抑制基因-1(SMG-1)(0.76±0.02 vs 1.39±0.02或0.79±0.02 vs 1.39±0.02)、p53(0.77±0.02 vs 1.24±0.03或0.82±0.03 vs 1.45±0.03)、p53-ser15(0.78±0.03 vs 1.50±0.02或0.82±0.02 vs 1.49±0.04)蛋白表达水平升高(P<0.05)。Circ_0003028靶向调控miR-498,沉默miR-498逆转了抑制circ_0003028表达对Huh7细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结论抑制circ_0003028表达通过靶向miR-498影响SMG-1/p53信号通路而抑制人肝癌细胞增殖、迁移和侵袭。

重楼皂苷Ⅰ对肝癌细胞株Huh7、HepG2细胞增殖的影响研究

目的探讨利用高内涵筛选(HCS)分析评价重楼皂苷Ⅰ(PPⅠ)对肝癌细胞株Huh7、HepG2细胞增殖的影响。方法以肝癌细胞株Huh7、HepG2细胞为研究对象,采用HCS技术分析细胞增殖相关参数,包括细胞形态、细胞迁移速度、细胞数量、细胞面积和细胞圆度等。结果不同浓度PPⅠ处理肝癌细胞株Huh7、HepG2细胞后,细胞皱缩且轮廓变得不明显。随着PPⅠ浓度增加,Huh7、HepG2细胞迁移速度、细胞数量增长速度逐渐变慢,且其细胞面积和细胞圆度值逐渐变小。结论PPⅠ能够抑制Huh7、HepG2细胞增殖和迁移。

迷迭香酸对人肝癌Huh7细胞增殖凋亡的影响及其分子机制

目的探究迷迭香酸(Rosmarinic acid,RA)对肝癌Huh7细胞增殖、凋亡的影响。方法选择人肝癌Huh7细胞作为研究对象,给予不同浓度的迷迭香酸处理,采用CCK8法测定其对Huh7细胞增殖的影响,流式细胞术检测肝癌Huh7细胞凋亡的变化,蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3表达的变化。结果迷迭香酸能够以剂量和时间依赖的方式抑制肝癌Huh7细胞的增殖(均P<0.01),RA作用后的肝癌Huh7细胞早期凋亡率显著升高(P<0.05)。结论RA可以抑制人肝癌Huh7细胞的增殖,并通过调节Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3蛋白促使其凋亡。

肝癌细胞自分泌外泌体通过TGF-β1调控自身细胞学行为

目的:研究肝癌Huh7细胞外泌体促进自身转移的机制。方法:培养肝癌Huh7细胞,分离提取外泌体并进行鉴定。将分离的外泌体与Huh7细胞共培养,Transwell比较细胞迁移和侵袭能力;检测外泌体中TGF-β1水平;实时荧光定量PCR和Western blot分别检测TGF-β1、SMAD2/3、EMT相关分子表达。结果:提取的外泌体经Western blot检出CD63、TSG101条带;透射电镜检测出双侧膜结构小体;纳米粒径分析显示颗粒大小集中在100 nm左右。外泌体中检出TGF-β1。外泌体与Huh7细胞共培养,免疫荧光显示外泌体成功进入Huh7细胞。与对照组相比,共培养组细胞迁移和侵袭大幅增加,TGF-β/Smad通路相关分子活化,上皮标志物E-钙黏蛋白、p-Smad7表达下降,间充质标志物-波形蛋白表达升高。结论:肝癌Huh7细胞自分泌的外泌体通过运输TGF-β1上调TGF/Smad通路进而影响肝癌转移,探明了肝癌发展机制,为肝细胞癌治疗提供了新思路。

miR-499在肝癌发生和发展中的作用机制研究

目的以肝癌细胞系Huh7细胞为模型,研究miR-499在肝癌发生和发展中的作用机制。方法通过TCGA和GEO数据库分析miR-499在肝癌患者及健康人中的表达差异,并通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测肝癌组织及正常癌旁组织中miR-499的表达差异。通过临床病例分析miR-499与肝癌患者临床指标的关系。采用CCK-8试验、集落形成试验检测miR-499对Huh7细胞活性及集落形成的影响。采用流式细胞术检测miR-499对Huh7细胞周期及相对凋亡率的影响。用TargetScan7.1、MicroRNA.org、MiRDB等数据库预测miR-499的下游靶基因。通过RT-qPCR及Western blot试验证明miR-499对RAB5C mRNA及蛋白水平的影响。结果TCGA和GEO数据库数据显示,miR-499在肝癌患者中呈低表达。RT-qPCR结果表明,miR-499在肝癌组织中的表达明显低于癌旁组织。临床数据整理表格显示,肝癌患者中miR-499高表达的患者普遍肿瘤体积较小、TNM分期较低、淋巴结转移能力较弱且分化良好。miR-499 mimics转染Huh7细胞后,通过CCK8试验和集落形成试验发现,miR-499抑制Huh7细胞增殖及集落形成能力。流式细胞术细胞周期与凋亡试验表明,miR-499抑制Huh7细胞的周期进程,并且促进Huh7细胞的凋亡能力。RT-qPCR及Western blot试验证明,RAB5C确为miR-499的靶基因。结论miR-499通过直接靶定并下调RAB5C的表达,从而抑制肝癌的发生和发展。

青蒿素抑制人肝癌细胞Huh7和SMMC-7721增殖及其机制

目的探讨青蒿素抑制肝癌细胞Huh7和SMMC-7721增殖的作用及其机制。方法不同浓度的青蒿素与人肝癌细胞Huh7和SMMC-7721共培养24、48、72 h后,采用Cell viability法检测细胞的增殖活性;细胞克隆实验检测细胞集落的抑制情况;流式细胞仪检测细胞的凋亡情况;Western Blot法检测细胞内蛋白水平的变化。结果Cell viability与细胞克隆实验的结果表明:与空白对照比较,青蒿素能够增加肝癌细胞Huh7和SMMC-7721的凋亡率。青蒿素通过抑制mTOR信号通路,进而抑制肝癌细胞Huh7和SMMC-7721的增殖。结论青蒿素能够抑制肝癌细胞Huh7和SMMC-7721的增殖,诱导其凋亡,且通过抑制mTOR信号通路活化抑制肝癌细胞Huh7和SMMC-7721的增殖,进而发挥抗肿瘤作用。

蟾蜍灵诱导肝癌Huh7细胞的凋亡及其机制研究

目的:研究蟾蜍灵(bufalin)诱导肝癌Huh7细胞的凋亡及其凋亡的初步机制。方法:CCK-8法检测不同浓度蟾蜍灵作用细胞不同时间后的细胞活性;Annexin V-FITC/PI双染试剂盒检测蟾蜍灵诱导的细胞死亡方式并分析细胞凋亡率;细胞活性氧ROS特异性抑制剂NAC预处理细胞1小时后,检测蟾蜍灵对细胞活性的影响,并采用Hoechst 33342染色技术染细胞核,在共聚焦显微镜下观察NAC对细胞凋亡的影响;采用流式细胞仪检测NAC对蟾蜍灵引起的细胞线粒体膜电位下降的影响。结果:10^(-9)、10^(-8)、10^(-7)、10^(-6)、10^(-5)mol/L蟾蜍灵分别作用细胞12、24、48小时后,细胞的活性呈浓度和时间依赖性降低;用10^(-7)mol/L这一浓度为接下来的实验浓度,流式双染结果表明10^(-7)mol/L蟾蜍灵诱导的细胞死亡为凋亡,凋亡率为42.9%,与星形孢菌素组引起的细胞凋亡分布类似;NAC预处理细胞1小时,再用蟾蜍灵作用细胞24小时后细胞活性为60.9±2.5%,明显比没有NAC预处理的细胞活性高,而且共聚焦显微镜和流式细胞核染色结果分别显示NAC预处理细胞可以减少蟾蜍灵引起的细胞凋亡和升高蟾蜍灵引起的线粒体膜电位的下降,升高的百分率为9.5%。结论:蟾蜍灵可以诱导肝癌细胞Huh7凋亡,ROS参与了蟾蜍灵诱导的细胞凋亡和线粒体膜电位的下降,本实验结果将为蟾蜍灵的临床使用和研究提供实验依据。

Fc受体样4蛋白在肝癌组织中的表达及对癌细胞Huh7生物学行为的影响

目的探讨Fc受体样4蛋白(FCRL4)在肝癌组织中的表达及对癌细胞Huh7生物学行为的影响。方法选取本院肿瘤科冰冻肝癌肿瘤组织及其邻近癌旁正常组织各40份,免疫组化法测定癌旁组、肝癌组中FCRL4的表达水平。设Huh7细胞组、FCRL4mimics组、FCRL4inhibitor组,培养72h后,测定细胞活力、凋亡、侵袭水平,RT-PCR法及蛋白印迹法测定各组细胞FCRL4基因和蛋白水平。结果肝癌组FCRL4蛋白阳性率明显高于癌旁组(P<0.05)。FCRL4mimics组OD值、存活率、穿膜数、FCRL4 mRNA和蛋白水平高于Huh7细胞组,FCRL4inhibitor组OD值、存活率、穿膜数、FCRL4mRNA和蛋白水平低于Huh7细胞组和FCRL4inhibitor组(P<0.05)。FCRL4mimics组凋亡率低于Huh7细胞组,FCRL4inhibitor组凋亡率高于Huh7细胞组和FCRL4inhibitor组(P<0.05)。结论肝癌中FCRL4过表达,FCRL4过表达能促进Huh7癌细胞增殖、侵袭,抑制其凋亡。