斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)肝脏表达的抗菌肽-2(LEAP-2)在E.coli中的融合表达

抗菌肽是存在于生物细胞中的一类具有强抗菌作用的天然小分子多肽,它们在机体免疫系统中发挥了重要作用,被认为是抗生素的理想替代品。本文通过RT-PCR法从斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)的肝脏中分离到抗菌肽-2(LEAP-2)基因,该基因编码94个氨基酸残基组成的多肽;氨基端的信号肽由28个残基组成,成熟肽含有41个残基;对于鱼类和哺乳动物显示高度保守的4个半胱氨酸残基位于多肽的羧基端区域。通过对LEAP-2基因添加EcoRI和HindIII酶切位点和对pET32a进行双酶切处理,成功构建了"pET32a-IpL-2"重组表达质粒,并转化工程菌E.coliBL21(DE3)。在工程菌对数生长后期加入诱导剂IPTG、经25℃培养后,可溶性的"trxA-IpL-2"融合蛋白得到高程度的表达。Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析表明,获得了高纯度的目的蛋白。

鸡Ⅱ型抗菌肽LEAP-2的原核表达及抑菌研究

为了研究鸡Ⅱ型抗菌肽LEAP-2的体外表达产物的活性,试验进行了肝脏样品无菌采集,基因的克隆及密码子优化和表达,以表达产物对致病菌做纸片法药敏试验,判断其抑菌作用。结果表明,试验经低温处理获得了较好的肝脏总RNA,克隆并优化了鸡LEAP-2基因;经诱导得到了表达产物,形式为包涵体;抑菌试验表明,表达产物对16株分离致病菌具有抑制作用。

小鼠LEAP-2基因的克隆及其真核表达质粒的构建

从小鼠肝中提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,获得了mLEAP-2基因编码区的cDNA,扩增出小鼠肝表达抗菌肽-2(mLEAP-2)成熟肽基因片段,重组入克隆载体pUCm-T,经DNA测序,该基因为120 bp,编码40个氨基酸。用限制性内切酶切下目的基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建成表达载体pPIC9-LEAP-2。重组毕赤酵母表达载体pPIC9-LEAP-2的结构,可望获得超量表达的高活性肝表达抗菌肽-2,为研制具有抗菌活性的新型基因药物奠定基础。

乌苏里白鲑肝脏表达抗菌肽Leap-2基因的克隆及细菌感染后的组织表达分析

为探究乌苏里白鲑Coregonus ussuriensis Berg肝脏表达抗菌肽Leap-2基因的分子结构和表达特征,采用PCR技术从乌苏里白鲑(体质量为30.0 g±1.2 g)肝脏组织中扩增Leap-2基因的开放阅读框(ORF),使用生物信息学软件对其编码的氨基酸序列进行分析,通过荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在健康组织及嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila、杀鲑气单胞菌Aeromonas salmonicida和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus感染后的组织表达变化。结果表明:采用PCR方法从乌苏里白鲑肝脏中克隆得到Leap-2基因的ORF区(GenBank:MZ170050),片段长度为276 bp,可编码91个氨基酸,其成熟肽区域包含4个高度保守的半胱氨酸残基;系统进化分析显示,乌苏里白鲑的Leap-2氨基酸序列与银鲑Oncorhynchus kisutch的亲缘关系较近,且具有较高的同源性,一致性为96.7%;乌苏里白鲑肝脏中的Leap-2基因表达量最高,其次为肠和肾,肌肉中的基因表达量最低;3种细菌感染导致Leap-2在各组织中的表达均有所上调,Western blot检测也显示,Leap-2蛋白水平在24 h内表达上调。研究表明,Leap-2基因参与了乌苏里白鲑应对外源干扰的免疫反应,本研究结果可为解析乌苏里白鲑应对病原体的免疫应答机制提供科学参考。

似鲇高原鳅LEAP-2基因序列特征及表达分析

【目的】研究似鲇高原鳅抗菌肽的生物学功能。【方法】通过似鲇高原鳅转录组测序数据库,获得LEAP-2基因序列。【结果】cDNA序列为2253 bp,其中5’非编译区(UTR)为270 bp, 3’UTR为1698 bp,开放阅读框为285 bp,编码94个氨基酸。信号肽预测结果显示LEAP-2信号肽包含28个氨基酸残基。似鲇高原鳅的LEAP-2与西藏高原鳅LEAP-2聚在一支,置信度为99%。组织分布结果表明,LEAP-2在健康似鲇高原鳅的鳃、肾脏、肝脏、肌肉、胃、脑、肠道、脾脏、皮肤、眼睛和心脏共11个组织中均有表达,其中,在似鲇高原鳅肝脏中的表达量最高,是鳃中表达量的2000多倍。在迟缓爱德华氏菌作用下,似鲇高原鳅LEAP-2 mRNA表达量在各免疫组织中呈现出不同的变化趋势。在粘膜相关组织皮肤、鳃和肠道中,细菌侵染后LEAP-2出现显著上调表达(P<0.05)。在系统性免疫组织脾脏、肝脏和肾脏中,肝脏中的LEAP-2在细菌侵染24 h时显著上调表达(P<0.05),随后下降;脾脏中LEAP-2先下降表达,随后显著上调表达(P<0.05),最终恢复到正常表达水平;肾脏中的LEAP-2在攻毒96 h上调表达(P<0.05)。【结论】似鲇高原鳅LEAP-2参与了机体对抗致病菌侵染的生物学过程。

抗菌肽对蛋鸡血清免疫指标及脾脏白细胞介素2 mRNA表达量的影响

本试验旨在研究饲粮不同水平抗菌肽对蛋鸡血清免疫指标及脾脏白细胞介素2(IL-2)mRNA表达量的影响。选用480只30周龄海赛克斯褐壳蛋鸡,随机分成4组,每组4个重复,每个重复30只鸡。对照组(Ⅰ组)饲喂基础饲粮,试验组分别在基础饲粮中添加200(Ⅱ组)、400(Ⅲ组)、600 mg/kg(Ⅳ组)抗菌肽,试验期4周。结果表明,饲粮中添加不同水平抗菌肽可不同程度地提高脾脏系数,其中Ⅲ组显著高于对照组(P<0.05)。与对照组相比,试验组血清免疫球蛋白A含量分别提高了7.69%(P>0.05)、19.40%(P<0.05)和14.38%(P>0.05),血清免疫球蛋白G含量分别提高了12.69%(P>0.05)、21.24%(P<0.05)和9.10%(P>0.05),而抗菌肽对血清免疫球蛋白M、补体3和补体4含量影响不显著(P>0.05)。Ⅱ组和Ⅲ组中脾脏IL-2 mRNA的表达量均显著高于Ⅰ组和Ⅳ组(P<0.05),Ⅳ组与Ⅰ组之间差异不显著(P>0.05)。由此可见,抗菌肽能提高蛋鸡的免疫功能,且饲粮中添加400 mg/kg抗菌肽效果最佳。

日本鳗鲡肝脏表达抗菌肽2基因的克隆与表达

为探讨鱼类抗菌肽基因的生物学功能,研究应用RACE方法克隆获得了日本鳗鲡(Anguilla japonica)肝脏表达抗菌肽2基因(Liver-Expressed Antimicrobial Peptide 2,LEAP-2),即AJLEAP-2的cDNA序列,全长为450 bp,开放阅读框编码89个氨基酸。其成熟肽含有LEAP-2保守基序"C-X5-C-X4-C-X4-C"。AJLEAP-2基因组结构与其他脊椎动物LEAP-2相同,都包含有三个外显子。利用荧光定量PCR检测了AJLEAP-2在日本鳗鲡不同组织/器官中的表达,发现其转录子在肝脏中表达量最高,是内参基因(β-acHn)的6倍;其次是肠道,但其表达量仅为肝脏的1/130。此外,还检测了AJLEAP-2在日本鳗鲡玻璃鳗(Glass eel)阶段的转录表达水平,结果显示,玻璃鳗中AJLEAP-2的转录表达量仅低于黑仔期的肝脏,为黑仔鳗肠道表达量的2倍。LPS和迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)刺激能显著上调鳗鲡血液中AJLEAP-2的转录表达,刺激16h后上调倍数最高,分别为对照组的86倍和12倍。此外,LPS刺激72h和E tarda刺激8h后,肠道中AJLEAP-2显著上调表达(P<0.05),为对照组的8倍。Poly I:C刺激24h后,血液中AJLEAP-2转录表达显著下调。结果表明,AJLEAP-2在日本鳗鲡抗细菌感染过程中起重要的作用。

牙鲆肝脏抗菌肽-2基因序列和表达分析

抗菌肽是鱼类先天免疫的组成部分,发现新的抗菌肽对于动物抗病机理的研究和寻找新药物有重要意义。经过对GenBank数据库中牙鲆EST文库进行同源比对后,筛选得到一个具有完整编码框的抗菌肽cDNA序列,结果再经过RT-PCR进行验证,命名为LEAP-2,对该序列进行注释,获得序列登录号EU586111。该抗菌肽能编码102个氨基酸的多肽,前28个氨基酸组成信号肽。推测编码蛋白质分子量为11 276.9 u,理论等电点(PI)为9.33。其蛋白质序列与另外9种鱼类的同源抗菌肽序列比较发现,同源性介于38.2%～61.7%。其中57至92位氨基酸为高度保守区,是维持其空间结构的主要区域,其中包含有4个保守的半胱氨酸,可能组成2个二硫键。荧光定量PCR分析显示,LEAP-2基因在肝脏中高表达,在牙鲆仔鱼不同发育时期中也有表达,但是表达水平存在明显差异,特别是在变态中期表达量比较高。

寻常性银屑病患者皮损中抗菌肽LL-37和人β防御素-2mRNA的表达

目的:探讨寻常性银屑病患者皮损中抗菌肽LL-37与人β防御素-2(hBD-2)mRNA的表达。方法:应用逆转录(RT)-PCR方法检测31例寻常性银屑病患者皮损和16例正常人皮肤组织中LL-37和hBD-2mRNA的表达。结果:与正常人皮肤组织相比,寻常性银屑病患者皮损中LL-37和hBD-2mRNA的表达水平明显升高(P<0.001)。结论:寻常性银屑病患者皮损中LL-37和hBD-2mRNA表达水平的上调可能与银屑病患者很少发生皮肤感染等有关。

蛙皮抗菌肽Brevinin-2Gub对2型糖尿病大鼠体重、血糖和胰岛素水平的影响

目的观察蛙皮抗菌肽Brevinin-2Gub对2型糖尿病大鼠体重、血糖和胰岛素水平的影响。方法 SD大鼠高糖高脂饲料喂养结合腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ)制备糖尿病大鼠模型,随机分成糖尿病组及Brevinin-2Gub治疗低、中、高剂量组,并设立正常对照组和正常给药组以及格列苯脲组。分别在Brevinin-2Gub各剂量组治疗3、7及14 d后,检测大鼠体重、空腹血糖和血清胰岛素变化。结果 Brevinin-2Gub中剂量组能够显著促进正常大鼠胰岛素分泌,但对体重、血糖没有显著影响,与糖尿病组比较,Brevinin-2Gub各剂量给药组大鼠体重显著上升、胰岛素水平均有明显升高,血糖明显降低,但变化幅度均低于格列苯脲。结论 Brevinin-2Gub可有效改善2型糖尿病大鼠糖尿病消耗症状,降低大鼠血糖,同时促进胰岛素分泌。

肝脏表达的抗菌肽-2

抗菌肽是在多种生物体中表达的具有抗菌活性的肽类物质的总称。肝脏表达的抗菌肽-2(liver-expressed antimicrobial peptide-2,LEAP-2)在肝脏中产生后分泌到血液中参与血液循环,从而发挥抗菌活性等作用。本文简要介绍LEAP-2的发现过程,对LEAP-2的基因组成、结构、诱导表达机理、抗菌活性以及基因调控等方面的研究进行综述,并展望LEAP-2可能的生理功能。

桔小实蝇抗菌肽Bactrocerin-2的分离纯化与鉴定

采用阳离子交换层析、RP-FPLC及RP-HPLC分离纯化技术,从细菌诱导的桔小实蝇蛹中分离鉴定出桔小实蝇抗菌肽Bactrocerin-1的同系物Bactrocerin-2。结果表明:Bactrocerin-2含有20个氨基酸残基,分子量为2 311.51 u,序列为VTKTWIKVIRGIGKSKIKWA;并且Bactrocerin-2与Bactrocerin-1的相似性极高,氨基酸同源性达到90%;该肽与鞘翅目Coleoptericin C-末端的20个氨基酸也具有较高的相似性。氨基酸组成分析结果表明,该肽是一种疏水、带正电荷的抗菌肽。该研究将有助于对昆虫天然免疫反应的认知,并为设计有效的抗菌分子奠定基础。

尖锐湿疣皮损中人β防御素(HDB)-2,3及LL-37的表达

目的:检测尖锐湿疣患者皮损中抗菌肽HBD-2、HBD-3及LL-37 mRNA的表达。方法:应用逆转录(RT-PCR)方法检测56例尖锐湿疣患者皮损和30名正常人皮肤组织中HBD-2、HBD-3及LL-37 mRNA的表达。结果:与正常人皮肤组织相比,尖锐湿疣患者皮损中HBD-2、HBD-3及LL-37 mRNA的表达水平明显升高(P<0.05)。结论:尖锐湿疣患者皮损中HBD-2、HBD-3及LL-37mRNA表达水平的上调可能与尖锐湿疣患者局部产生免疫防御有关。

抗菌肽NZ2114对多重耐药2型猪链球菌感染小鼠的治疗效果评价

为探究抗菌肽NZ2114对猪链球菌感染小鼠模型的体内治疗效果,本试验以NZ2114和2型猪链球菌CVCC 3928为研究对象,利用小鼠模型评价NZ2114治疗猪链球菌感染的效果。36只ICR雌鼠随机均分为6组:空白对照组(不感染,腹腔注射0.2mL PBS)、阴性对照组(感染,腹腔注射0.2mL PBS)、试验Ⅰ和Ⅱ组(感染,分别腹腔注射0.2mL 2.5和5.0mg/kg NZ2114)、阳性对照Ⅰ和Ⅱ组(感染,分别腹腔注射0.2mL 7.5和15.0mg/kg头孢曲松钠)。结果显示,空白对照组和5.0mg/kg NZ2114试验组小鼠存活率均为100%,而15.0mg/kg头孢曲松钠阳性对照组小鼠存活率仅为50%。治疗1d后,5.0mg/kg NZ2114试验组小鼠肺脏和肝脏荷菌量分别下降59.41%(P<0.01)和69.19%(P<0.01);而15.0mg/kg头孢曲松钠阳性对照组中小鼠肺脏和肝脏荷菌量分别下降43.94%(P<0.01)和19.60%(P<0.05)。与阴性对照组相比,2.5 mg/kg NZ2114治疗组中抑制炎性因子TNF-α和IL-1β的释放分别下降85.83%(P<0.01)和56.20%(P<0.05),5.0 mg/kgNZ2114试验组分别降低84.02%(P<0.01)和43.86%(P<0.05),而15.0mg/kg头孢曲松钠阳性对照组TNF-α及IL-1β的下降率均不显著,分别为24.49%和8.82%。另外,5.0mg/kg NZ2114试验组1d后即可明显减轻小鼠肺组织间质弥漫性炎细胞浸润等炎症症状,抑制肝细胞产生肿胀及空泡性变化,促进脾小结恢复正常;治疗7d后各器官组织临床症状评分基本恢复正常。上述结果表明,NZ2114能有效提高猪链球菌感染小鼠的存活率,显著降低病原菌在小鼠肺脏和肝脏的移位及血清中TNF-α和IL-1β的水平,并有效缓解肝脏、脾脏和肺脏的急性损伤,治疗效果优于头孢曲松钠,具有作为治疗临床猪链球菌病抗生素替代品的潜力。

人β-防御素2在大肠杆菌中的高效表达和纯化

目的:研究具有生物学活性的人防御素2(HBD 2)多肽在大肠杆菌中的原核高效表达的可行性及融合表达蛋白的分离纯化技术。方法:PCR扩增不含前导序列的HBD 2成熟肽的编码框全长的cDNA片段(smHBD 2-cDNA),利用B g lⅡ和B amHⅠ同尾酶构建多拷贝串联的nsmHBD 2-cDNA的克隆载体,利用N colⅠ和H indⅢ限制性内切酶构建融合表达载体pET 32-nsmHBD 2-cDNA,在大肠杆菌中BL 21(DE 3)中诱导表达含HBD 2的融合蛋白,SDS-PAGE分析产量。可溶蛋白经亲和层析、肠激酶酶切、离子交换层析等方法分离、纯化HBD 2多肽。采用液体培养法,测定重组人β防御素2对大肠杆菌的抑菌活性。结果:构建了n为1、2、4或8倍的多拷贝串联nsmHBD 2-cDNA表达载体,1、2和4倍smHBD 2-cDNA的可溶蛋白比例分别为52%、48%和31%;而8倍HBD 2-cDNA几乎不含可溶蛋白,目标蛋白以包含体形式表达,集中在不可溶部分。重组HBD 2对E.coli K 12 D 31有较强的抑制作用,在终浓度约为0.4至0.5μg/m l时,90%细胞的生长被抑制。结论:采用融合表达、多拷贝串联表达方式,可增加产物长度以弱化蛋白酶的降解作用,也减弱了目标蛋白产物对宿主的毒性;适当的多拷贝串联基因可以提高HBD 2的产量,但拷贝数过高会影响重组蛋白表达产量,且易形成不溶蛋白;在大肠杆菌中可达到具有生物学活性的HBD 2多肽的原核高效表达。

多肽突变体Cbf-14-2抗青霉素耐药细菌的活性研究

本研究主要探讨了新型多肽突变体Cbf-14-2对携带NDM-1基因重组菌(E.coli BL21(DE3)-NDM-1)的抗菌活性及机制。实验采用肉汤倍比稀释活菌计数法测定多肽对E.coli BL21(DE3)-NDM-1重组菌的MIC/MBC和杀菌曲线,评价多肽的体外抗菌活性;采用重组菌腹腔感染法建立小鼠败血症模型,评价多肽的体内抗菌活性;通过Zeta电位分析和流式细胞术探讨Cbf-14-2抗耐药细菌感染的作用机制。结果表明,多肽Cbf-14-2对携带NDM-1基因的耐药细菌具有良好的抗菌活性(MIC=16μg/m L),能在2 h内快速杀灭细菌;同时,多肽能显著降低感染小鼠肝、脾、肺和肾脏等组织的细菌负载量,对细菌显示出强效清除能力,将小鼠存活率由10%提高至70%。这主要由于Cbf-14-2能与细菌细胞膜表面负电荷发生静电结合,增加对膜的穿透能力。因此,Cbf-14-2有望成为治疗NDM-1耐药细菌诱发感染的潜在抗菌剂。

中老年2型糖尿病牙周炎患者龈沟液抗菌肽水平及其与牙周临床指标的相关性

目的探究牙周炎合并2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者龈沟液中抗菌肽人β防御素2(human betadefensin2,HBD2)和LL37的水平变化规律及其与牙周临床指标的相关性。方法选取于深圳市慢性病防治中心口腔科和内科就诊的中老年人(45至85岁)为研究对象,分为全身健康并牙周健康对照组22人、全身健康牙周炎组19人、T2DM牙周健康组15人、T2DM合并牙周炎组21人。采用佛罗里达牙周探针进行牙周检查,记录受试者牙周临床指标,包括探诊深度(probing depth,PD)、附着水平(attachment level,CAL)和探诊出血(probing bleeding,BOP)。采用酶联免疫吸附法检测龈沟液中抗菌肽HBD2、LL37浓度,比较组间抗菌肽HBD2、抗菌肽LL37及牙周临床指标间的差异,并进行相关性分析。结果T2DM合并牙周炎组的PD值大于全身健康牙周炎组(P<0.05);全身健康牙周炎组龈沟液中HBD2和抗菌肽LL37水平均高于全身健康并牙周健康对照组(P<0.05),全身健康牙周炎组龈沟液中HBD2水平高于T2DM合并牙周炎组(P<0.05)。全身健康牙周炎组龈沟液中抗菌肽HBD2、LL37与PD、CAL呈正相关(P<0.05),T2DM合并牙周炎组龈沟液中抗菌肽HBD2、LL37与PD、CAL相关性无统计学意义(P>0.05)。结论中老年T2DM牙周炎患者龈沟液抗菌肽HBD2、LL37水平较低,与牙周临床指标PD、CAL无显著相关性。

人β防御素2与口腔扁平苔藓相关性的研究进展

口腔扁平苔藓(oral lichen planus, OLP)是一种常见的口腔黏膜慢性免疫性炎症疾病,OLP的病因和发病机理目前尚未阐明,在临床诊疗过程中存在着诸多问题且OLP存在癌变风险,故OLP的发生发展及临床诊疗方面的研究历来受到重视。近年来的一些研究表明,OLP的发生与人β防御素2(humanβdefensin-2,hBD-2)有着密切关系。该文就OLP与hBD-2的相关研究进展进行总结及分析。

俄罗斯鲟肝脏表达抗菌肽2基因的分子特征及抗菌活性分析

肝脏表达抗菌肽2(liver-expressed antimicrobial peptide 2,LEAP-2)在鱼类先天免疫系统中发挥重要作用。本研究通过RACE技术获得了俄罗斯鲟LEAP-2(Acipenser gueldenstaedti LEAP-2,AgLEAP-2)的全长c DNA序列,对其序列特征和表达水平进行了分析;构建Ag LEAP-2原核表达载体并对重组蛋白进行纯化;进一步采用琼脂稀释法初步检测Ag LEAP-2蛋白的抑菌活性。结果显示,AgLEAP-2基因c DNA全长为622 bp,开放阅读框(ORF)为246 bp,预测编码81个氨基酸,分子量约为11.2 kDa,5′端非编码区为184 bp,3′端非编码区为192 bp。Ag LEAP-2包含一个信号肽(1~25 aa)和一个成熟肽(26~81 aa),成熟肽含有4个保守的半胱氨酸残基,在Cys58-Cys69和Cys64-Cys74的相对位置之间各形成一个二硫键的核心结构。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,AgLEAP-2在所有健康组织中广泛表达,在肝脏中表达水平最高,在肠道和肌肉中表达水平次之,在鳃中表达量最低。与0 h相比,Ag LEAP-2在感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)后的不同时间点的肝脏、脾脏、肠道、头肾、鳃和血液组织中均显著上调。此外,重组Ag LEAP-2蛋白(r Ag LEAP-2)在体外对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有抗菌活性并存在剂量效应。本研究表明,AgLEAP-2可能在俄罗斯鲟的先天免疫系统中发挥重要作用且对多种病原菌有一定的抗菌效果,本研究为开发新的抗菌制剂提供了依据。

猪白细胞介素-2和融合抗菌肽重组酵母菌构建及其对小鼠免疫和生长的协同效应

为了开发经济实用的新型免疫调节剂,以2A自剪切技术构建重组毕赤酵母Pichiapastoris共同表达猪白细胞介素-2(IL-2)和融合抗菌肽基因,然后以重组基因工程酵母菌饲喂ICR小鼠,以实时荧光定量PCR、ELISA和流式细胞计数评估其对小鼠免疫力和生长的影响。实验结果显示,处理组(融合抗菌肽重组酵母菌、IL-2和融合抗菌肽重组酵母菌)小鼠的生长明显优于对照组(空质粒酵母菌)(P <0. 05),且血清Ig G、Ig G1和Ig G2a含量显著升高(P <0. 05); TLR1、TLR4、TLR6、TLR9、IL-7、IL-15、IL-23、CD62L、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、CRP4和CAMP基因的表达水平显著增加(P <0. 05)。同时,处理组小鼠血液白细胞Th和Tc细胞明显增多(P <0. 05),免疫力和存活率均明显高于对照组(P <0. 05)。重组酵母菌能有效增强小鼠的先天和获得性免疫力,促进生长,可进一步开发成安全有效的免疫调节生物制剂,改善动物的生长和免疫力。