不同氧化态叶酸对人成淋巴细胞系基因组DNA甲基化水平的影响

目的比较最高氧化态叶酸(folic acid,FA)与还原态5-甲基四氢叶酸(5-methyltetrahydrofolate,5-MeTHF)对人成淋巴细胞LINE-1和Alu的甲基化效应,从而评价受试物对全基因组DNA甲基化的影响。方法以含30、60和120 nmol/L FA或5-MeTHF的改良RPMI1640培养液干预培养人成淋巴细胞系GM12593,20 d后提取基因组DNA,用亚硫酸盐修饰测序法(BSP)比较不同浓度和氧化态叶酸对受试细胞Alu和LINE-1甲基化水平的影响。结果基因组Alu和LINE-1甲基化水平均随FA或5-MeTHF浓度的升高而增加,两目标序列的甲基化水平在120 nmol/L FA或5-MeTHF浓度下显著高于30和60 nmol/L组(P【0.01~0.05),60和120 nmol/L的5-MeTHF提高LINE-1甲基化水平的能力显著高于同等浓度的FA(P【0.01~0.05)。结论 FA和5-MeTHF浓度与人成淋巴细胞基因组DNA甲基化水平显著正相关,5-MeTHF的基因组甲基化维护效应强于FA。

肝细胞癌血浆LINE-1启动子区甲基化水平的研究

目的探讨肝细胞癌(HCC)患者血浆中长散布核元件-1(LINE-1)基因启动子区CpG位点甲基化水平变化的临床意义。方法应用亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)检测33例HCC患者(HCC组)、18例肝硬化患者(肝硬化组)及16例健康志愿者(正常组)的外周血血浆中LINE-1启动子区的CpG位点甲基化程度。结果 HCC组的LINE-1启动子区多个CpG位点甲基化水平及整体甲基化水平下降;进一步通过ROC曲线分析发现CpG位点1、位点7、位点8的甲基化水平对诊断HCC的能力较优,其敏感度和特异度分别为80.0%和78.8%、81.8%和71.4%、82.9%和75.8%。结论 LINE-1基因启动子区甲基化水平在HCC中明显下降,其中CpG位点1、位点7、位点8的甲基化水平可能对HCC诊断有意义。

LINE-1ORF-1p对ERα阳性乳腺癌细胞的体外影响研究

目的探讨人反转座子长散在重复序列编码蛋白1(LINE-1 ORF-1p)对ERα阳性乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响及可能机理。方法利用Lipofectin 2000将LINE-1 ORF-1的表达载体及其空载体,siRNA及其空载体转染进入ERα阳性乳腺癌细胞ZR75-1细胞。使用MTT法测定LINE-1 ORF-1p对ERα阳性乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响;利用Luciferase检测LINE-1 ORF-1p对ERα转录活性的影响。结果 MTT法观察结果发现,LINE-1 Flag-ORF-1p能够显著促进ZR75-1细胞的生长(P=0.018)。LINE-1 ORF-1p siRNA表达载体能够抑制ZR75-1细胞的生长(P=0.022),其体外抑制率为E2-:25.51%,P=0.025,E2+:64.29%,P=0.021。LINE-1 Flag-ORF-1p能够升高ERα的转录活性(P=0.008)。LINE-1 ORF-1psiRNA表达载体能够降低ERα的转录活性(P=0.015),结论 LINE-1 ORF-1p能够通过升高ERα的转录活性,促进乳腺肿瘤细胞ZR75-1生长。

L1-ORF2对GES-1细胞衰老的影响及分子调控机制研究

目的探讨长散在核元件1读码框2基因(L1-ORF2)对GES-1细胞衰老的影响及分子调控机制。方法采用高糖诱导法构建GES-1细胞衰老模型,构建L1-ORF2 si RNA载体,脂质体法将其瞬时转染正常及衰老的GES-1细胞,转染48h后用细胞计数法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪分析细胞周期,β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况,Western blotting检测转染细胞中L1-ORF2、P53、P21蛋白表达水平。结果成功构建了稳定的GES-1细胞衰老模型及L1-ORF2si RNA载体。与转染了阴性对照载体的细胞相比,转染L1-ORF2 si RNA载体的正常及衰老GES-1细胞的L1-ORF2表达均下降(P<0.05)。与转染阴性对照载体的衰老GES-1细胞相比,转染L1-ORF2 si RNA载体的衰老GES-1细胞增殖速度变快(P<0.05),G0/G1期比例明显减少(34.2%vs 39.3%,P<0.05),β-半乳糖苷酶染色比例下降(56%vs 69%,P<0.05),而转染阴性对照载体和L1-ORF2 si RNA载体的正常GES-1细胞相比则无明显差异(P>0.05)。P53蛋白仅在衰老GES-1细胞中有表达,在正常GES-1细胞中无表达,而P21蛋白在正常和衰老的GES-1细胞中均有表达,且后者表达更高(P<0.05)。与转染阴性对照载体的细胞相比,转染L1-ORF2 si RNA载体的GES-1细胞P53、P21蛋白表达量明显下降(P<0.05)。结论L1-ORF2 si RNA载体可使正常及衰老的GES-1细胞中L1-ORF2表达下调,促进衰老GES-1细胞的生长和增殖,而对正常GES-1细胞无明显影响。P53、P21蛋白参与了L1-ORF2调控细胞衰老的过程。

高危型人乳头瘤病毒阳性的宫颈癌组织中L1基因甲基化水平变化及意义

目的观察持续性高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）阳性的宫颈癌组织中长散布核元件-1（L1）基因甲基化水平变化,并探讨其意义。方法收集HR-HPV均阳性的正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变（CIN）I组织、CINⅡ~Ⅲ组织及宫颈癌组织各30份。采用亚硫酸氢盐转化结合焦磷酸测序技术对所有组织DNA的L1序列3个Cp G位点进行甲基化定量检测,评价其对子宫颈癌和CIN的诊断价值。结果正常宫颈组织、CINⅠ组织、CINⅡ~Ⅲ组织及宫颈癌组织中L1基因平均甲基化水平分别为0.590±0.053、0.570±0.038、0.560±0.025、0.490±0.054,宫颈癌组织中L1基因平均甲基化水平与其他组织中比较,P均〈0.001。选取L1基因启动子区甲基化水平的截断值为53.17%,此时其判断宫颈病变性质的灵敏度及特异度均为86.70%。95%置信区间（CI）为0.834~0.976。结论HR-HPV阳性的宫颈癌组织中L1基因甲基化水平明显降低。L1基因启动子区甲基化水平为53.17%时,有助于宫颈病变性质的判断。

DNA甲基化在结直肠癌诊断中的研究进展

随着表观遗传学中DNA甲基化的深入研究,人们发现CpG岛(CpG island)DNA甲基化在结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的临床诊断中发挥重要作用。目前,研究证实检测CRC患者组织、粪便和血液中基因的异常甲基化在CRC的早期筛查和诊断中具有很高的敏感性和特异性。本文就胞裂蛋白9(septin 9,SEPT9)、多配体聚糖2前体(syndecan 2 precursor,SDC2)、波形蛋白(vimentin,VIM)、p16和长散布核苷酸元件-1(long interspersed nucleotide element-1,LINE-1)5个基因的甲基化及其在CRC诊断中的相关进展进行了综述。

Global hypomethylation in hepatocellular carcinoma and its relationship to aflatoxin B_1 exposure

AIM:To determine global DNA methylation in paired hepatocellular carcinoma(HCC) samples using several different assays and explore the correlations between hypomethylation and clinical parameters and biomarkers,including that of aflatoxin B 1 exposure.METHODS:Using the radio labeled methyl acceptance assay as a measure of global hypomethylation,as well as two repetitive elements,including satellite 2(Sat2) by MethyLight and long interspersed nucleotide elements(LINE1),by pyrosequencing.RESULTS:By all three assays,mean methylation levels in tumor tissues were significantly lower than that in adjacent tissues.Methyl acceptance assay log(mean ± SD) disintegrations/min/ng DNA are 70.0 ± 54.8 and 32.4 ± 15.6,respectively,P = 0.040;percent methylation of Sat2 42.2 ± 55.1 and 117.9 ± 88.8,respectively,P < 0.0001 and percent methylation LINE1 48.6 ± 14.8 and 71.7 ± 1.4,respectively,P < 0.0001.Aflatoxin B 1 albumin(AFB 1-Alb) adducts,a measure of exposure to this dietary carcinogen,were inversely correlated with LINE1 methylation(r =-0.36,P = 0.034).CONCLUSION:Consistent hypomethylation in tumor compared to adjacent tissue was found by the three different methods.AFB 1 exposure is associated with DNA global hypomethylation,suggesting that chemical carcinogens may influence epigenetic changes in humans.

IGF2 differentially methylated region hypomethylation in relation to pathological and molecular features of serrated lesions

AIM: To investigate insulin-like growth factor 2 (IGF2) differentially methylated region (DMR)0 hypomethylation in relation to clinicopathological and molecular features in colorectal serrated lesions.

L1(ORF1)基因通过编码和非编码RNA表达对细胞增殖的影响

目的探索L1(ORF1)基因过量表达对细胞增殖的影响。方法 PCR方法制备L1(ORF1)全长以及5'端不同截短的天然序列以及各种突变体,构建真核重组表达载体,利用脂质体方法瞬时转染HEK293细胞,Western印迹方法验证蛋白表达,利用活细胞计数试剂盒(CCK-8)进行细胞增殖能力分析。结果过表达天然全长蛋白[L1(ORF1)]的重组体能明显促进细胞增殖,终止密码位于第109个氨基酸位置的全长序列重组体[L1(ORF1)109]对细胞增殖同样具有非常明显的促进作用,但仅含有氨基端109个氨基酸的基因片段的重组体对细胞增殖没有促进作用。另外,终止密码位于其他位置的全长序列重组体[L1(ORF1)48,终止突变在第48个氨基酸位置]以及含有多处突变的全长序列重组体[L1(ORF1)m]对细胞的增殖也未见有显著影响。结论 L1(ORF1)全长序列编码蛋白具有显著地促进细胞增殖作用,同时在特殊位点含有终止突变的全长序列转录产物对细胞的增殖也具有显著促进作用,L1(ORF1)全长序列可能通过其编码的蛋白以及非编码RNA两种形式对细胞增殖进行调控,位于序列中的关键位点在此过程中起着重要的作用,为探索L1(ORF1)序列在细胞增殖中的调控机制奠定了基础。